ICS 67.050 SN X 04 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4963—2017 出口水产品中维氏气单胞菌检验方法 DeterminationofAeromonasVeroniinseafoodforexport 2017-11-07发布 2018-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 SN/T4963—2017 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国吉林出人境检验检疫局、吉林农业大学、中华人民共和国惠 州出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：孟庆峰、单晓枫、周宇、王伟利、魏春艳、姚贵哲、孟日增、王伟琳、 吴连鹏、宋战昀、李海滨、刘阳、蔡阳、刘金华。 S SN/T4963—2017 出口水产品中维氏气单胞菌检验方法 1范围 本标准规定了水产品中维氏气单胞菌（AeromonasVeroni）的检验方法。 本标准适用于水产品中维氏气单胞菌的检验。 2 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 3生物安全措施 为了保护实验室人员的安全，应由通过生物安全培训并具备资质的工作人员进行检测，所有培 养物和废充物应参照CB19489中的有关规定执行。 4 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌与培养设备外，其他设备与材料如下。 4.1 冰箱：2℃~8℃。 4.2 恒温培养箱：28℃ ±1℃ 36℃ ±1℃。 4.3 水溶或其他恒温装置：28℃ ±1℃， 100℃±1℃ 4.4 电子天平：感量0.1 4.5 均质器。 4.6 显微镜：10×~100×。 4.7 离心机：离心力≥20000g。 4.8 移液器：量程0.5μL~10μL，量程10μL~100μL，量程100μL~1000μL。 4.9 核酸蛋白分析仪。 基因扩增仪。 4.10 4.11 电泳仪。 4.12 凝胶成像分析系统。 5培养基和试剂 除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中一级水的要求。 5.1RS鉴别培养基：见附录A中A.1。 5.2 胰蛋白陈大豆蛋白陈琼脂（TSA）：见附录A中A.2。 SN/T4963—2017 5.3碱性蛋白陈水（APW）：见附录A中A.3。 5.41mol/LTris-HCl缓冲液（pH8.0）：称取121.1gTris，溶于800mL小中，搅拌，加入浓盐酸 42mL，冷却至室温，用稀盐酸准确调整pH至8.0，分装后高压灭菌备用。 5.50.5mol/LEDTA（pH8.0）：在800mL水中加人186.1gNaz-EDTA·2H,0，用磁力搅拌器剧烈搅拌， 用氢氧化钠调节浓度pH至8.0，然后定容至1L，分装后高压灭菌备用。 5DNA提取液：量取100mL1mol/LTris-HCl缓冲液（5.4），50mL0.5mol/LEDTA，称取5.0g 5.6 SDS，16.848g氯化钠，定容至1L，分装后高压灭菌备用。 5.7 引物：见表1。 表1 引物序列、 目的基因和扩增片段长度 引物名称 引物序列 目的基因 片段长度/bp PI 5'-GGGATAACTACTGGAAACGGTA-3' 16S rRNA 343 P2 5'-GTAACGTCACAGCTGGCAGT-3' 5.8 TaqDNA聚合酶（5U/μL）。 5.9 dNTP （2.5 mmol/L)。 5.10 10×PCR缓冲液。 5.11 DNA Marker。 5.12 质控参考菌株：ATCC35624、ATCC9071（或其他可溯源的菌株）。 5.13 10×上样缓冲液。 5.14 琼脂糖：电泳级。 5.15 溴化乙锭：10mg/mL。 5.16 50×TAE电泳储备液：称取484gTris，量取114.2mL乙酸，200mL0.5mol/LEDTA（pH8.0） (5.5), 溶于蒸馏水中，定容至2L。分装后高压灭菌备用。 第一法 常规检测法 6检验程序 检测程序见图1。 SN/T4963—2017 检样 样品25g±1%氯化钠碱性蛋白陈水 225mL, 28 ℃ ± 1℃, 18 h ~ 24 h 划线培养RS琼脂 28℃±1℃,18h~24h 纯培养TSA 28 ℃±1 ℃,18 h~24h → 革兰氏染色一 氧化酶试验+ 粘丝试验一 吲哚试验+ H2S试验+ 维氏气单胞菌确认实验 V.P.反应 赖氨酸脱羧酶 燕糖 D-甘露醇 溶血 吡嗪酰胺 → 报告 图1 检测程序 7 检测步骤 7.1 增菌 称取25g样品置于盛有225mLAPW（5.3）的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min~2min。 于28℃±1℃培养8h~10h。 7.2 分离培养 用接种环接取1环增菌培养液划线接种于RS琼脂，于28℃±1℃培养18h~24h。维氏气单胞 3 SN/T4963—2017 菌在RS琼脂培养基上典型菌落为圆形，部分菌株边缘略微粗糙、湿润、扁平、颜色黄色，刮去菌落 有黄色的菌落痕迹。挑取3个~5个革兰氏染色为阴性短杆菌（部分菌株呈多形性）的菌落，接种 TSA琼脂平板进行纯化培养。 7.3维氏气单胞菌的初筛试验 7.3.1氧化酶试验 用接种环挑取琼脂平板上单个菌落少许涂布于无菌滤纸片上，滴加氧化酶试剂，10s内观察细菌 涂布处的颜色，出现红色即判定为阳性，不变色表明氧化酶试验阴性。维氏气单胞菌应为阳性。 7.3.2粘丝试验 在无菌载玻片上滴加一滴粘丝试验试剂，用接种环从平板上挑取一个氧化酶阳性可疑菌落，在 试剂中混匀。能拉出长丝者为阳性，否则为阴性，维氏气单胞菌应为阴性。 7.3.3吲哚试验 挑取琼脂平板上氧化酶阳性的可疑菌落穿刺接种AHM鉴别培养基，于36℃±1℃培养24h， 在长有细菌的顶部滴加3滴~4滴Kovacs试剂。形成红色玫瑰明吲哚即为阳性，不变色为阴性。维氏 气单胞菌应为阳性。 7.3.4H,S试验 在CCF半固体琼脂培养基试管内穿刺接种，置于36℃±1℃培养，经过72h孵化沿穿刺线弥 漫状发出黑色介质，为阳性反应。疑似气单胞菌者（符合初筛试验特征）应做进一步试验。 7.4维氏气单胞菌的确认试验 可采用生化试验，或商品化的鉴定试剂、全自动和半自动生化鉴定系统进行鉴定，维氏气单胞 菌的生化反应见附录B。 8结果报告 综合上述检验结果，报告检样单位中检出或未检出维氏气单胞菌。 第二法 PCR法 9检测步骤 9.1样品处理、增菌和分离 样品处理、增菌和分离按第一法进行。 9.2PCR模板的制备 取1mL增菌液至8000r/min离心5min，弃上清液，加入50μLDNA提取液，振荡混匀，于 98℃加热5min，以12000r/min离心5min，取上清液作为模板。可疑菌落则直接加人50μLDNA提取 液并进行后续提取。也可使用等效的商品化的DNA提取试剂盒并按其说明提取制备DNA模板。