ICS 11.020 SN C 62 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T49702017 国境口岸麻疹病毒实时荧光 RT-PCR检测方法 Detection method formeasles viral by real-time fluorescence RT-PCR at frontier port 2017-11-07发布 2018-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 SN/T 49702017 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国吉林出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：丁旭、刘阳、宋屿竹、杨怀宁、李升、李义光、马文晨、杨迪、孙丽华、 石杨。 SN/T4970—2017 国境口岸麻疹病毒实时荧光 RT-PCR检测方法 1范围 本标准规定了国境口岸人出境人员麻疹病毒的实时线光RT-PCR检测方法，包括样本采集、处 理，检验、结果判定、报告和生物安全措施。 本标准适用于国境口岸人出境人员麻疹病毒的实时荧光RT-PCR检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB19489实验室生物安全通用要求 WS233生物和生物医学实验室生物安全通用准则 可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定（中华人民共和国卫生部令第45号） 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 麻疹病毒measlesvirus 麻疹的病原体，属于副粘病毒科麻疹病毒属，核心为单负链RNA。 4检测对象 国境口岸麻疹染疫嫌疑人及密切接触者。 5 实验室生物安全要求 5.1检测工作中的个人防护按照GB19489。 5.2实验室应按照GB19489和WS233对生物安全2级（BSL-2）实验室的生物安全要求。 5.3实验室废弃物应遵照GB19489对废弃物的处理要求进行无害化处理。 5.4样本运输应按照《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》的相关规定。 实验室应遵循GB19489和WS233对生物安全2级（BSL-2）实验室的生物安全要求。 警示：使用本标准的人员应有正规实验室实践经验。本标准并未指出所有可能的安全问题。使用 者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家相关的法规规定的条件。 6仪器和材料 6.1实时荧光PCR仪及配套PCR反应管。 1 SN/T4970—2017 6.2 普通台式离心机。 6.3 高速冷冻离心机：最大离心力20000g。 6.4 二级生物安全柜。 6.5 微量可调移液器（10μL、100μL、200μL、1000μL）及配套带滤芯吸头。 6.6 普通冰箱（2℃~5℃、20℃）。 6.7 超低温冰箱（-80℃） 6.8 旋涡振荡器。 6.9 高压蒸气灭菌器。 6.10 紫外灯：波长360nm~366nm，功率≤6W。 6.11 去RNANase洁净离心管。 6.12 无水乙醇（分析纯）。 6.13 核酸提取试剂。 6.14 RT-PCR试剂。 6.15去RNANase的DEPC水。 6.16引物和探针序列（见表1）。 表1引物和探针序列 序列(5'-3'） 引物／探针名称 参考毒株GenBank序列号 扩增片段 FP CTAGCCTTAGGYGTRATCA 预期扩增片段 RP GGAACTGAGTTTGACATC JN 997484 153bp Probe FAM caaCatAccTacCtgcggBHQ1 注：引物序列中的简并碱基Y为C或T，R表示G或A，探针的5’端标记的是FAM荧光报告基团，3'标记 的是BHQI荧光淬灭基团，探针序列中大写字母表示LNA修饰碱基。其他等效荧光标记物和淬灭基团或等效的 引物和探针及商品化试剂盒也可采。 1 检测（格式） 7.1样本采集、保存和转运 7.1.1血清：用一次性无菌采血针抽取受检者静脉血2mL，注入含促凝剂的真空采血管，3000r/min 离心10min，取上层血清进行检测。标注唯一标识，-70℃以下保存待检。 7.1.2血浆：用一次性无菌采血针抽取受检者静脉血2mL，注人肝素钠抗凝的真空采血管，3000r/min 离心10min，取上层血浆进行检测。标注唯一标识，-70℃以下保存待检。 7.1.3咽拭子：用无菌棉签适度用力试抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部：将棉签放人装有 12mL~2mL保存液（维持液或生理盐水）的采样管中，弃掉手指接触部位，旋紧管盖并密闭送检。标 注唯一标识，采集新鲜的咽拭子样本应保存在4℃条件下，未能在24h内送至实验室的，应置-70℃ 或以下保存待检。 7.1.4疑似麻疹病毒感染材料的包装及转运应符合《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种 或样本运输管理规定》。 7.2核酸提取 核酸提取按试剂盒进行或其他等效核酸提取方法，实际操作时按说明书进行。 2 SN/T 49702017 7.3实时荧光RT-PCR检测 7.3.1待试剂充分融化后，将试剂离心30s。 7.3.2 麻疹病毒实时荧光RT-PCR的反应体系，按表2加人。 表2麻疹病毒实时荧光RT-PCR的反应体系 成分 体积 DEPC水 7.5 μ L RT-PCR缓冲液 10 μ L 20 μmol/L PrimerFP 0.5 μ L 20 μmol/L PrimerRP 0.5 μL 5 μmol/L probe 0.5 μ L RT-PCR酶 1.0 μ L 模板RNA 5.0 μ L 注：麻疹病毒实时荧光RT-PCR的反应总体系为25μL。 每个反应体系均设立阴性对照和阳性对照，阳性对照模板为含麻疹病毒的核酸片段，阴性对照模板 为不含麻疹病毒目的基因的样本或去RNANase的DEPC水。 7.3.3 3将加好样的PCR反应管转移至实时荧光定量PCR仪上进行检测。应用罗氏LigheCycler96PCR仪 反应程序为：45℃×10min；95℃×15min；95℃×15s，60℃×60s，循环40次，选用FAM通道。 不同实验室可根据所使用的试剂和仪器参考上述反应条件作适当调整。 3结果计算 8 8.1 Ct值确定 以荧光PCR反应的6个～15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，以本底信号标准差的10倍 作为荧光阈值，以样本扩增产生的荧光信号达到荧光阈值时所对应的循环数为循环阈值（Ct值）。 8.2 质量控制 反应结果应同时符合以下2个条件，否则试验结果无效 阴性对照无扩增曲线； 阳性对照Ct值≤35并有明显扩增曲线。 实时荧光RT-PCR检测结果判定及报告 8.1 如果Ct值≤35，并有明显扩增曲线，报告为麻疹病毒荧光PR-PCR检测阳性； 如果无Ct值或Ct值>40，且无明显扩增曲线，报告为麻疹病毒荧光PR-PCR检测阴性； 如果Ct值在35~40之间的样本建议重做，若重做结果仍然有明显扩增曲线，则该样本判为麻疹 病毒荧光RT-PCR检测阳性，否则为阴性。 3 SN/T 49702017 7.3实时荧光RT-PCR检测 7.3.1待试剂充分融化后，将试剂离心30s。 7.3.2 麻疹病毒实时荧光RT-PCR的反应体系，按表2加人。 表2麻疹病毒实时荧光RT-PCR的反应体系 成分 体积 DEPC水 7.5 μ L RT-PCR缓冲液 10 μ L 20 μmol/L PrimerFP 0.5 μ L 20 μmol/L PrimerRP 0.5 μL 5 μmol/L probe 0.5 μ L RT-PCR酶 1.0 μ L 模板RNA 5.0 μ L 注：麻疹病毒实时荧光RT-PCR的反应总体系为25μL。 每个反应体系均设立阴性对照和阳性对照，阳性对照模板为含麻疹病毒的核酸片段，阴性对照模板 为不含麻疹病毒目的基因的样本或去RNANase的DEPC水。 7.3.3 3将加好样的PCR反应管转移至实时荧光定量PCR仪上进行检测。应用罗氏LigheCycler96PCR仪 反应程序为：45℃×10min；95℃×15min；95℃×15s，60℃×60s，循环40次，选用FAM通道。 不同实验室可根据所使用的试剂和仪器参考上述反应条件作适当调整。 3结果计算 8 8.1 Ct值确定 以荧光PCR反应的6个～15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，以本底信号标准差的10倍 作为荧光阈值，以样本扩增产生的荧光信号达到荧光阈值时所对应的循环数为循环阈值（Ct值）。 8.2 质量控制 反应结果应同时符合以下2个条件，否则试验结果无效 阴性对照无扩增曲线； 阳性对照Ct值≤35并有明显扩增曲线。 实时荧光RT-PCR检测结果判定及报告 8.1 如果Ct值≤35，并有明显扩增曲线，报告为麻疹病毒荧光PR-PCR检测阳性； 如果无Ct值或Ct值>40，且无明显扩增曲线，报告为麻疹病毒荧光PR-PCR检测阴性； 如果Ct值在35~40之间的样本建议重做，若重做结果仍然有明显扩增曲线，则该样本判为麻疹 病毒荧光RT-PCR检测阳性，否则为阴性。 3