ICS 11.020 SN C 62 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T49722017 国境口岸溶血性链球菌实时 荧光PCR检测方法 Detection of Streptococcus hemolyticus by real-time fluorescence PCR assays at frontier port 2017-11-07发布 2018-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 SN/T 49722017 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国珠海出入境检验检疫局、深圳市计量质量检测研究院。 本标准主要起草人：史咏梅、兰全学、汪海波、林霖、严琼英、李意、冯子力、莫秋华、杨国武、 戴慧蓉。 SN/T4972-2017 国境口岸溶血性链球菌实时 荧光PCR检测方法 1范围 本标准规定了国境口岸溶血性链球菌实时荧光PCR检测的对象、样本采集、检验程序、结果报 告及阳性结果处理。 本标准适用于国境口岸实验室对溶血性链球菌（A、C、G群）的炎光PCR险测。 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB4789.1食品安全国家标准食品微生物学检验总则 GB4789.111 食品安全国家标准食品微生物学检验β型溶血性链球菌检验 GB 14934 4食品安全国家标准消毒餐（饮）具 GB 19489 实验室生物安全通用要求 SN/T 1193 基因检验实验室技术要求 WS/T230 临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用 全国临床检验操作规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 溶血性链球菌S Streptococcushemolyticus 属于链球菌属，其广泛存在于水、空气、尘埃、粪便及健康人和动物的口腔、鼻腔、咽喉中， 可通过直接接触、空气飞沫传播或皮肤、粘膜伤口感染，而被污染的食品如奶、肉、蛋及其制品也 会对人类产生感染。在血平板上菌落周围能形成完全透明的无色溶血环，称乙（β）型溶血，因而 亦称乙型溶血性链球菌。该菌能引起败血症、食物中毒等，对人体健康危害较大。根据链球菌细胞 属于A族，B、C、D和G群偶见对人致病，A族链球菌常引起各种类型的化浓性感染，故又称为 化脓性链球菌。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 4.1FAM:6-羧基-荧光素（6-carboxy-fluorescein） 4.2 2TAMRA:5-羧基四甲基罗丹明（carboxytetramethyIrhodamine） 1 SN/T4972—2017 检测对象 5.1待检溶血性链球菌（A、C、G群）菌株。 5.2国境口岸溶血性链球菌感染者或疑似感染者的呕吐物、排泄物、咽拭子、血液、化脓性病变组织 及其增菌液。 5.3被污染的或有污染嫌疑的食品、食（饮）具，一次性卫生用品等及其增菌液。 6 生物安全和PCR防污染要求 实验室生物安全应符合GB19489的规定。PCR防污染措施按WS/T230和SN/T1193的规定执行。 7 主要仪器 7.1 二级生物安全柜。 7.2 恒温培养箱：36℃±1℃。 7.3 旋涡振荡器。 7.4 冰箱：4℃、-20℃和-70℃。 超净工作台。 7.5 7.6 微型离心机。 7.7 实时荧光PCR仪。 7.8 水浴锅：36℃±1℃。 7.9 高压灭菌锅。 7.10 超纯水器或双蒸水器 7.11 微量可调移液器一套（含以下5种规格：10μL、20μL、100μL、200μL、1mL)。 8 主要试剂 8.1 无菌拭子。 8.2 改良胰蛋白陈大豆肉汤。 8.3 哥伦比亚CAN血琼脂。 8.4 哥伦比亚血琼脂。 8.5 灭菌生理盐水。 8.6 Hank's液。 8.7 pH值7.4的PBS。 8.8 灭菌双蒸水。 8.9 酚。 8.10 三氯甲烷。 8.11 无水乙醇。 8.12 70%乙醇。 TE液。 8.13 8.14 荧光PCR引物应为PAGE以上级别纯化，引物序列见10.5.1。 8.15 实时荧光PCR反应试剂：PremixExTaq(2×）。 2 SN/T4972-2017 9检测程序 溶血性链球菌荧光PCR检测流程见图1。 待检样品 增菌培养 不增菌直接检测 增菌液提取 提取DNA DNA 实时荧光PCR检测 Ct-35，判断为 Ct=40，判断为 35<Ct<40，重新 阳性结果 阴性结果 测试 35<Ct<40，曲线有明显的 35<Ct<40，曲线无明显的 对数增长期，判断为阳性 对数增长期，判断为阴性 图 1 溶血性链球菌荧光PCR检测流程 10 检测步骤 10.1 样本采集 10.1.1 粪便和呕吐物样本采集 10.1.1.1 粪便样本采集 采集排出的新鲜大便于灭菌容器中，水样便采集1mL~3mL，成形便采集1g~3g（为保证粪便样 本在运送过程中不变干，可在盛装标本的容器中加入200μL灭菌生理盐水）；亦可用已湿润的直肠 拭子由肛门插入直肠内3cm~5cm处并轻轻旋转，确保退出的拭子上有可见的粪便，把拭子收入灭菌 容器中。粪便样本宜在发病早期（发病4d内），服用抗菌药物之前采集。 10.1.1.2呕吐物样本采集 采集自然呕吐的呕吐物于灭菌容器中，水样呕吐物采集1mL~3mL，非水样呕吐物采集 1 g~3 go 1）给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可和推荐。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使 用这些等效产品。 3 SN/T4972—2017 10.1.1.3沾有粪便、呕吐物的物体样本采集 沾有粪便、呕吐物的衣物或其他物体样本的采集，用灭菌拭子挑取1mL~3mL或1g~3g于灭菌 容器中。 10.1.2食品样本采集 10.1.2.1各种食品的样本采集方法按GB4789.1的规定 10.1.2.2如被采集的食品样本量小于25g时，可全部采集。 10.1.3咽拭子样本采集 通常采用含转运培养基的无菌拭子。采集前被采样者应用清水反复漱口，由检查者将舌向外拉， 使聘垂尽可能向外牵引，将拭子通过舌根到咽后壁或聘垂的后侧，涂抹数次，但拭子要避免接触口腔 和舌粘膜。将拭子放入含转运培养基（一般为2mLHanks液）的无菌离心管中，拭子接触手的部分 应及时折断或剪断去掉，然后盖紧试管。 10.1.4化脓性病变组织样本采集 软组织的急性化脓性炎症、化脓性疾病、脓肿和创伤感染等部位的取样中，对开放性感染和已 溃破的化脓灶，标本采集前先用灭菌生理盐水冲洗表面污染菌，再用灭菌拭子采取脓液及病灶深部的 分泌物。盛于灭菌容器内送检。闭锁性脓肿，可行手术引流或穿刺法取标本于灭菌容器或灭菌注射器 内送检。样本尽可能多取。 10.1.5血液样本采集 以无菌方式，抽取静脉血转移至无菌离心管中，4h内分离血清；或抽取静脉血转入含EDTA抗 凝剂的无菌真空采血管中，4h内分离血浆。 10.1.6食（饮）具、一次性卫生用品的采集 该类标本的采集按GB14934要求执行。 10.1.7其他物体表面样本的采集 用灭菌拭子蘸以无菌生理盐水涂抹可疑部位，置于灭菌容器中。 10.1.8样本采集的其他要求 10.1.8.1以卫生质量评价为目的的样品采集，注意采样的代表性或针对性 10.1.8.2以查明突发公共卫生事件或疾病暴发流行的原因为目的的样品采集，不要求样品的代表性， 强调针对性，尽可能采集病原微生物含量最多的部位和足够检测用的样本。 10.1.8.3调查中毒的样品既包括食品、水和食品接触的相关人员的样品，又包括中毒者的呕吐物、排 泄物、血液等临床标本，而中毒的原因样品往往只能一次性提供。 10.1.8.4如用拭子采样时，宜采集2个 10.1.8.5所有采样用具、容器需严格灭菌，并以无菌操作采样。 10.2样本运送与保存 10.2.1一般从样本采集后到运送至实验室的时间不超过2h，否则应保存在4℃~8℃条件下送检， 10.2.2原则是尽快检测，不能于当天进行检验的样本，可选择4℃~8℃保存，24h内检验。如检毕 的样本需保存3个月以内，宜在-18℃以下冷藏；如检毕的样本需保存3个月以上，宜在-70℃以下 冷藏。 4