ICS 65.020.01 SN B 16 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T49762017 陈旧昆虫标本的DNA提取 磁珠方法 DNA extraction of timeworn insect specimens- Magneticmuthod 2017-11-07发布 2018-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 SN/T 4976—2017 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国江苏出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：郑斯竹、安榆林、杨晓军、李洋、花婧、陈景芸、高渊 SN/T4976—2017 陈旧昆虫标本的DNA提取磁珠方法 1范围 本标准规定了陈旧昆虫标本的DNA磁珠提取方法。 本标准适用于多年保存昆虫干标本、液浸标本等多种处理方式的陈旧昆虫标本的DNA提取。 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本 文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682一2008分析实验室用水规格和试验方法 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 陈旧昆虫标本 timeworninsectspecimens 不同保存方式处理，保藏多年的昆虫标本。 3.2 超顺磁性纳米微球 superparamagneticsnanobeads 纳米磁珠 具有磁响应性的纳米级粒子，其直径一般小于30nm，当磁性粒子的粒径小于其超顺性临界尺寸 时，粒子进入超磁性状态。 4原理 根据多聚核苷酸与羚基修饰的磁性纳米粒子具有分散性好、易于功能化和磁分离的特性，利用 其表面可非特异吸附DNA，不吸附蛋白分子、细胞碎片、多糖等细胞成分的功能，实现陈旧昆虫标 本提取过程中DNA与其他细胞成分的有效分离，完成DNA的高效富集。 5仪器、用具和试剂 5 5.1仪器和用具 磁力架、微量紫外分光光度计、离心机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、水浴锅、微量移液器 (0.1μL~0.25μL，2μL~20μL,20μL~200μL，100μL~1000μL)。 5.2 2试剂及溶液 （采用GB/T6682一2008中规定要求） 1 SN/T4976—2017 无水乙醇、10×电冰上样缓冲液、琼脂糖、9%NaCl溶液、PBS缓冲液（pH=7.2）（缓冲液配比： 135mmol/LNaC1、2.7mmol/LKCl、1.5mmol/LKH,PO4、8mmol/LK,HPO。）、纳米磁珠、裂解缓冲液、蛋 白酶K。 6实验方法 6.1标本提取前处理 6.1.1干标本提取前处理 将昆虫干标本用无菌水冲洗4次并吸干水分后放人离心管，0.9%NaCl溶液浸泡3h。 6.1.2乙醇浸渍标本提取前处理 无菌水浸渍洗涤3次~5次，沥干水分备用。 6.1.3福尔马林浸渍标本前处理 样品放入PBS液浸泡12h～24h；加70%的乙醇中处理12h～24h；80%乙醇浸泡2h，重复一次； 90%乙醇浸泡2h，重复一次；95%乙醇浸泡2h，重复一次；100%乙醇浸泡1h，重复一次样品放人 1/2倍的PBS缓冲液中浸泡12h，其间更换一次溶液。 6.2DNA提取 陈旧昆虫部分肌肉组织（<30mg）冷冻研磨后与200μL裂解缓冲液与蛋白酶K一起置于2mL离 心管，55℃加热1h～3h；往裂解完成液中加人20μL纳米磁珠，用旋涡振荡器混匀数秒，静置结合 约10min。期间每隔3min，再用旋涡振荡器混匀数秒；室温高速离心数秒，在磁力架上弃上清液， 保留纳米磁珠；加人100L70%乙醇清洗纳米磁珠，高速短时离心，在磁力架上弃上清液，重复上一 步醒1次；加人50μL超纯水洗脱，55℃加热10min；室温高速离心数秒，将上清液转移至新离心管， 该上清液即为分离提取的基因组DNA，-20℃保存备用。 7结果判定 利用紫外分光光度计检测DNA样品的纯度及浓度。利用目的基因的通用引物针对目的基因进行 PCR扩增，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，获得清析的目的条带即说明提取的DNA有效 2 SN/T4976—2017 参考文献 [1］吴婷，易黎，黄莹，吴军，纳米磁珠法与试剂盒法分析载脂蛋白E基因的多态性[J］.中 国组织工程研究，2013，17（38）：6804-6809. ［2］郑斯竹，安榆林、徐梅等，天牛幼虫保存与DNA提取方法比较研究［J］.中南科技大学学 报（自然版），2012，32（325）：144-148. 【3］郑斯竹，安榆林，徐梅等，多年保存天牛科标本的DNA微量提取方法［J］.植物检疫 2012，26（3)：30-34 【4］李棚霖，郑斯竹，蔡平等，不同预处理方法对昆虫干标本DNA提取效果影响［J】.基因组 学与应用生物学，2015，34（2）：396-402 ［5］魏亦寒，郑斯竹，蔡平等，粉标本保存与DNA提取方法的比较［J】.应用昆虫学报 2015，52（4):925-932. 3 SN/T4976—2017 参考文献 [1］吴婷，易黎，黄莹，吴军，纳米磁珠法与试剂盒法分析载脂蛋白E基因的多态性[J］.中 国组织工程研究，2013，17（38）：6804-6809. ［2］郑斯竹，安榆林、徐梅等，天牛幼虫保存与DNA提取方法比较研究［J］.中南科技大学学 报（自然版），2012，32（325）：144-148. 【3］郑斯竹，安榆林，徐梅等，多年保存天牛科标本的DNA微量提取方法［J］.植物检疫 2012，26（3)：30-34 【4］李棚霖，郑斯竹，蔡平等，不同预处理方法对昆虫干标本DNA提取效果影响［J】.基因组 学与应用生物学，2015，34（2）：396-402 ［5］魏亦寒，郑斯竹，蔡平等，粉标本保存与DNA提取方法的比较［J】.应用昆虫学报 2015，52（4):925-932. 3