ICS 11. 100 SN A 80 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T5158--2019 化学品 鉴别雌激素受体激活剂和抗剂的 BG1Luc雌激素受体转录激活试验方法 ChemicalsBG1Luc estrogen receptor transactivation test method for identifying estrogen receptoragonists and antagonists 2019-10-25发布 2020-05-01实施 中心 中华人民共和国海关总署 发布 G955550021027 中华人民共和国出人境检验检疫 行业标准 化学品 鉴别雌激素受体激活剂和拮抗剂的 BG1Luc雌激素受体转录激活试验方法 SN/T 51582019 * 中国海关出版社有限公司出版发行 北京市朝阳区东四环南路甲1号（100023) 编辑部：(010)65194242-7509 网址www.customskb.com/book 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 * 开本880×12301/16印张0.5字数14千字 2020年10月第一版2020年10月第一次印刷 印数1—500 * 书号：155175·274定价14.00元 SN/T5158—2019 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准参考了联合国经济合作发展组织(OECD)化学品试验导则No.457《鉴别雌激素受体激活剂 和拮抗剂的BG1Luc雌激素受体转录激活试验方法》（英文版）。 本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国天津海关。 本标准主要起草人：赵琢、张园、杨磊、刘伟、左玥华、张卉。 SN/T5158—2019 化学品！ 鉴别雌激素受体激活剂和拮抗剂的 BG1LUC雌激素受体转录激活试验方法 1范围 本标准规定了鉴别化学品雌激素受体激活剂和拮抗剂的BG1Luc雌激素受体转录激活试验方法的 术语和定义、原理、试验、试验报告。 本标准适用于化学品雌激素受体激活剂和拮抗剂的筛查和检测试验。 2术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2. 1 激活剂agonist 与特定受体结合时能产生某种反应（如转录）的物质。 2. 2 拮抗剂antagonist 与特定受体结合时能抑制反应（如转录)的物质。 2. 3 转录激活 transactivation(TA) 响应特定化学信号的mRNA合成（如雌激素与雌激素受体结合信号）。 2. 4 17β-雌二醇17β-Estradiolum（E2） 一种笛体雌激素。 3原理 体外转录激活实验是基于受试物和相应受体结合后发挥转录激活作用，进而启动报告基因表达。 在脊椎动物中，雌激素受体存在两种亚型，ERα和ERβ。两种不同的受体在其生物学功能、组织特异性 和与配体的亲和性上都存在明显不同。ERα调节经典的雌激素反应，因此，目前大多都以ERα研究雌 激素受体的转录激活作用。BG1Luc是整合了荧光素报告基因的人卵巢癌细胞系，可表达内源性ERα 以及一小部分ERβ。因此，可用BG1LucER转录激活试验来检测化合物的雌激素样转录激活作用，同 时也可以研究化合物作用机制原理。 4试验 4.1准备和条件 4.1:1细胞系 此实验用稳定转染的BG1Luc4E2细胞系。 SN/T5158—2019 4.1.2细胞系的稳定性 为维持细胞系的稳定性和完整性，BG1Luc4E2细胞系应经过细胞维持液中30次的传代，培养时间 应为3个月。 4.1.3细胞培养 细胞培养步骤应确保所有材料和方法的质量。BG1Luc4E2细胞培养时，在RPMI1640培养液中加 人0.9%链霉素和8.0%小牛血清，然后放置于37℃±1℃、90%土5%的湿度、5.0%士1%C02的空 气条件中培养。BG1Luc4E2细胞培养一旦达到80%，为测试分析荧光酶素活性表达对于雌激素的依 懒性，在将亚细胞放于96孔板之前，先将亚细胞置于无雌激素的培养液中培养48h。非雌激素溶剂包 括无酚红的DMEM培养基，加人4.5%活性炭/葡萄糖处理过的胎牛血清、1.9%L-谷酰胺、0.9%链 霉素。 4.1.4溶剂 受试物应被溶于二甲基亚砜（DMSO)中，其量不应超过1.0%（体积分数），参比标准和对照溶解于 100%的溶剂，然后在非雌激素溶剂中稀释。 4.1.5受试物的准备 受试物溶于100%的DMSO,然后在非雌激素溶剂中稀释。受试物在溶解和稀释时均在适宜的室 温下进行，溶液应现配现用，且无明显沉淀和浑浊。 4.2检测试验 4.2.1溶解度和细胞毒性 4.2.1.1浓度 适宜浓度范围测试由7点组成，1：10连续稀释。应先测试受试物最大浓度，即激活剂的最大浓度 是1mg/mL，拮抗剂的最大浓度为20μg/mL。 4.2.1.2细胞毒性 实验中细胞活性/毒性的评估方法应采用定量方法判断，造成20%细胞死亡的受试物的浓度数据 不可用。 4.2.2受试物暴露和检测板组成成分 细胞计数将细胞置于有非雌激素溶剂的96孔板，每孔2×105个细胞中，孵育24h，以使细胞贴附 于板。洗去并取代非雌激素溶剂，加入参照物质，孵育19h～24h。 4.2.3综合检测 综合检测组成如下：11点连续稀释（基于综合实验起始浓度的1：2或1：5稀释），每3个孔检测1 种浓度。激活剂的综合实验用11种E2浓度及参比标准。4个孔用于DMSO对照，4个孔用于甲氧氯 (9.06×10-°mol/L)对照。拮抗剂的综合实验用9种雷洛昔芬/E2和参比标准，即浓度为9.18×10-11mol/L E2。4个孔用于E29.18×10-11mol/L对照，4个孔用于DMSO对照，4个孔用丁三苯氧胺浓度为 3.36X10-‘mol/L对照。对于相同物质的综合实验，应该在不同的时间重复，以确保独立性。 2 SN/T5158—2019 4.2.4发光度测量 发光度在300nm～500nm范围内用注射光度计和控制测量间距及注射量的软件测量。每个孔的 光发射值用RLU表示。 4.2.5EC50/IC5o测定 ECso值[受试物最大半数有效浓度（激活剂)和ICso值E受试物半数最大抑制浓度（拮抗剂)决定于 浓度一反应曲线。对于在一个或多个浓度下都呈现阳性结果的物质，受试物浓度所致的半数最大反应 （EC5o/ICso）利用希尔性能分析方法计算。与受试物浓度反应相关的4种参数的逻辑数学模型（S型曲 线）见式(1)： (Top-Bottom) Y=Bottom+ (1 ) 1 + 10( ig E s0X)HillSlope 式中： Y 反应值(RLU)； X 一浓度对数； Bottom 最小反应值； TOP 最大反应值； 1gECso（或IgICso）=X对数介于最大值和最小值之间。 该模型计算了最合适的Top、Bottom、Hillslope、ICso和ECso参数、ICso和ECso的计算。 5试验报告 5.1受试物和对照受试物 主要包括以下内容： -识别数据（原始资料、纯度、杂质等）； 理化性质（挥发性、稳定性、溶解度）； 如果是混合剂，标明其组成成分及各成分的比例。 5.2细胞 主要包括以下内容： 细胞来源； -细胞在解冻时的传代次数； 来自解冻的细胞传代次数； 维持细胞培养的方法。 5.3检测条件 主要包括以下内容： 细胞毒性数据和可溶性的局限性； 受试物浓度； 溶剂和受试物的量； 孵育温度、湿度、CO2和浓度； -培养时间； 3 SN/T 5158—2019 SN/T5158—2019 培养期间细胞密度。 5.4可接受性检测 5.4.1 浓度范围检测 主要包括以下内容： DMSO对照RLU值（均值、SD、CV)； 每个实验板的双重诱导或降低值； E2对照值（仅限于拮抗剂）； 试验成功与否；如果失败，那就不是标准的做法。 5.4.2 综合实验 主要包括以下内容： -DMSO对照RLU值（均值、SD、CV)； 每个实验板的双重诱导或降低值； 阳性对照结果； 参比标准结果； -E2对照结果（仅限于拮抗剂）； 试验成功与否；如果失败，那就不是标准的做法。 5.5结果 主要包括以下内容： 发光信号的原始数据和标准数据； 每种受试物的稀释比（1：2或1：5）； 受试物的结果是阳性、阴性和还是不充足； -ICso/ECso值是否正确； 统计分析，误差和置信区间的测量（如SEM、SD、CV或95%CI)，并说明这些数据是怎么获 得的。 5.6分析讨论 5.7结论 书号：155175：274 定价： 14.00元 SN/T 5158-2019