ICS 65.020.30 CCS B 40/49 DB 51 四川省 地方 标准 DB51/T 3011—2023 山羊胚胎生产与冷冻保存技术规范 2023 - 02 - 07发布 2023 - 04 - 08实施 四川省市场监督管理局 发布 DB51/T 3011 —2023 I 目次 前言 ................................ ................................ ................. II 1 范围 ................................ ................................ ............... 1 2 规范性引用文件 ................................ ................................ ..... 1 3 术语和定义 ................................ ................................ ......... 1 4 胚胎生产 ................................ ................................ ........... 1 5 胚胎质量检测 ................................ ................................ ....... 4 6 胚胎冷冻保存 ................................ ................................ ....... 4 7 解冻 ................................ ................................ ............... 5 附录A（资料性） 各种液体配制 ................................ ......................... 6 附录B（资料性） 胚胎装管示意图 ................................ ....................... 8 附录C（资料性） 检胚记录表 ................................ ........................... 9 DB51/T 3011 —2023 II 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由四川省农业农村厅提出、归口和解释。 本文件主要起草单位：四川省畜牧总站、四川农业大学。 本文件主要起草人：杨舒慧、张明、张红平、李强、王小强、曹伟、周光斌、曾长军、程莲、洪宁、 王莉娟、张勇。 本次为首次发布。DB51/T 3011 —2023 1 山羊胚胎生产与冷冻保存技术规范 1 范围 本文件规定了山羊胚胎生产与冷冻保存的术语和定义、胚胎生产、质量检测、冷冻及解冻的技术要 求。 本文件适用山羊胚胎生产与冷冻保存。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 NY/T 1571 羊胚胎移植技术规程 NY/T 1674 牛羊胚胎质量检测技术规程 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 超数排卵 Superovulation 利用外源性促性腺激素诱发母羊卵巢多个卵泡发育，并排出多个具有受精能力的卵子的方法。 3.2 体外受精 In vitro fertilization 山羊的精子和卵子在人工控制的体外环境中完成受精过程。 3.3 玻璃化冷冻 Vitrification 利用含有高浓度的渗透性抗冻保护剂溶液处理胚胎， 然后将胚胎装入冷冻载体并直接投入液氮快速 降温，使液体形成玻璃态，可有效减少冷冻过程中有害冰晶的形成，使胚胎所受物理性伤害大大降低的 一种胚胎冷冻方法。 3.4 慢速降温冷冻 Slow-freezing 利用含有低浓度的渗透性抗冻保护剂溶液处理胚胎， 然后将胚胎装入冷冻载体并按照一定程序于程 序冷冻仪中植冰和降温，最后置于液氮中保存的一种冷冻方法。 3.5 体外受精胚 in vitro -fertilized embryo 通过体外受精获得的胚胎。 4 胚胎生产 DB51/T 3011 —2023 2 超数排卵胚生产 4.1 4.1.1 药品与器械的准备 孕酮阴道栓 （ CIDR） 、 氯前列烯醇 （ PGF2α） 、 促卵泡素 （ FSH） 、 人绒毛膜促性腺激素 （ HCG） （或促黄体素（ LH），或促排 3号）、青霉素、链霉素、复合麻醉剂、 PBS液（附录 A1）、冲胚液 （附录 A2）、胚胎操作液（附录 A3）、生理盐水、 75%酒精、碘酊；手术台、植栓枪、羊用冲胚 管、滞留针（ 18G）、手术剪、手术刀、止血钳、缝针（圆针、三棱针）、外科手术缝线、注射器、 体视显微镜、恒温台、检胚皿、培养皿 4.1.2 供体母羊选择 所选用供体母羊必须符合品种要求或标准（有国标或地标的品种，参照品种标准），连续三代内系 谱清楚、健康无病，发育到性成熟后，繁殖机能正常的个体。 4.1.3 饲养管理 保持饲养环境适宜、卫生、 温度稳定，避免应激； 制定合理的供体羊日粮配方， 保证蛋白质、 能量、 维生素和微量元素等营养平衡，保持中等膘情；供给清洁饮水，适当运动。 4.1.4 超数排卵 用植栓枪将 CIDR（含孕酮 300mg～500mg）放入供体母羊阴道内，放置 CIDR之日为0d，第9d第二次补 栓， 第15d起早晚间隔 12h肌肉注射 FSH， 注射总量 100IU～200IU（或10mg～15mg） ， 每天按照总量的 5:3:2 递减连续注射 3d，第16d上午注射完 FSH后立即撤 CIDR，同时注射氯前列烯醇 2ml。孕酮、 FSH具体计量见 下表：孕酮、FSH具体计量 见表1。 表1 孕酮、FSH具体计量 体型品种 CIDR中孕酮 FSH 地方品种 培育品种 地方品种 培育品种 大型 500mg 400mg 200IU/15mg 150IU/13mg 中型 450mg 350mg 175IU/13.5mg 125IU/11.5mg 小型 400mg 300mg 150IU/12mg 100IU/10mg 4.1.5 发情鉴定与诱导排卵 注射完FSH后，观察母羊发情情况。对有发情征兆的母羊，采用公羊试情，以供体母羊愿意接受试 情公羊爬跨， 判断为发情。 做好发情时间记录， 同时静脉注射 HCG 500IU ～800IU， 或肌注LH 50IU～100IU， 或肌注促排 3号10μg～20μg。诱导排卵激素具体剂量见下表： 诱导排卵激素具体剂量 见表1。 表2 诱导排卵激素具体剂量 体型品种 HCG LH 促排 3号 地方品种 培育品种 地方品种 培育品种 地方品种 培育品种 大型 800 IU 700IU 100IU 80 IU 20μg 16μg 中型 700 IU 600IU 85IU 65 IU 18μg 14μg 小型 600 IU 500IU 70IU 50 IU 16μg 10μg DB51/T 3011 —2023 3 4.1.6 配种 可采用自然交配或人工授精进行发情母羊的配种。自然交配配种 2次，人工授精输精 3次。发情 时立即配种 1次，每间隔 12h再配第 2或第 3次。人工授精，可使用鲜精或冻精，鲜精活力 ≥0.7以上， 冻精解冻后活力 ≥0.3，每次输精有效精子数不低于 3×107个，输精容积 0.5ml～1ml。 4.1.7 手术冲胚 采用 NY/T 1571中5.1部分。 体外受精胚生产 4.2 4.2.1 药品和器械的准备 超数排卵药品、 消毒药品、 外科手术器械和常用器械见 4.1.1。 肝素、 卵母细胞体外成熟培养液、 体外受精液、早期胚胎体外培养液； CO 2培养箱、 CO 2钢瓶、超净工作台。 4.2.2 卵母细胞收集 4.2.2.1 活体取卵 按照 4.1.2选择供体母羊， 按照 4.1.4对供体母羊进行超数排卵处理。 在第 6次注射 FSH前12h禁食， 最后 1次FSH注射 12h，参见 NY/T 1571 中5.1中外科手术方法暴露卵巢，用生理盐水浸润的纱布包裹 卵巢，用预吸有抽卵液（附录 A4），用带 12号针头的 5 ml注射器抽吸卵巢上所有直径 3mm～6 mm 的有腔卵泡中的卵丘卵母细胞复合体（ COCs）和卵泡液，抽吸完后将抽吸物盛在直径 60 mm的