ICS 65.020.02 B 05 DB64 宁夏回族自治区地方标准 DB64/T 1203--2016 枸杞品种鉴定技术规程 SSR分子标记法 2016-12-28 发布 2017-03-28实施 宁夏回族自治区质量技术监督局 发布 DB64/T 1203-2016 前 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由宁夏回族自治区林业厅提出并归口。 本标准起草单位：宁夏农林科学院构杞工程技术研究所、国家枸杞工程技术研究中心。 本标准主要起草人：安巍、尹跃、赵建华、曹有龙、李彦龙、戴国礼、何军、焦恩宁、王亚军、 樊云芳、张曦燕、梁晓婕。 DB64/T 1203—2016 枸杞品种鉴定技术规程SSR分子标记法 1范围 本标准规定了利用简单重复序列（Simplesequencerepeats，SSR）分子标记进行枸杞品种DNA指 纹鉴定的试验方法、数据记录格式和判定标准。 本标准适用于枸杞SSR标记分子数据采集和品种鉴定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T19557.1一2004植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南总则 NY/T2558-2013植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南枸杞 3术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 特定引物 本文件中所指引物专门适合于枸杞SSR扩增的引物。 3. 2 参照品种 具有所用SSR位点上不同等位变异的品种。参照品种用于辅助确定待测样品的等位变异，校正仪 器设备的系统误差。 3. 3 待检样品 送检单位提供的待鉴定的枸杞种质、品系、品种。 4原理 SSR广泛分布于枸杞基因组中，不同枸杞品种每个SSR位点重复基元重复次数可能不同。设计特 异性引物对SSR进行聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）扩增，扩增产物的片段长度通 过毛细管电泳技术，或变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和硝酸银染色加以区分。不同的枸杞品种间遗传组成存 在差异，某些SSR位点重复次数不同显示不同条带，从而实现品种差异鉴定。 1 DB64/T1203--2016 51 仪器设备及试剂 仪器设备及试剂见附录A。 6 溶液配制 溶液配制方法见附录B。 7SSR特定引物 引物相关信息见附录C。 8参照品种及其使用 参照品种见附录D。 在进行等位变异检测时，应同时包括参照品种的PCR扩增产物。 注1：同一名称不同来源的参照品种的某一位点上的等位变异可能不相同，在使用其他来源的参照品种时，应与原 参照品种核对，确认无误后使用。 注2：对于附录C未包括的等位变异，应按本标准方法，重新设计引物，确定大小。 9操作程序 9.1样品准备 试验样品为待测枸杞样品和参照品种的组织。参照品种采用3个以上重复，同时进行分析。 9.2DNA提取 DNA提取方法及步骤如下： 选取100mg枸杞组织置于2mL离心管中，加液氮研磨至粉末； b) 离心管中加入800uL预热（65℃）2%CTAB提取液，轻摇混匀； c) 65℃水浴1h，期间每隔10min轻摇1次； d) 冷却至室温后加入800μL氯仿：异戊醇（24:1），混匀20min; e) 10000rpm离心10min; f) 吸取200uL上清液移到1.5mL的离心管中，加入600uL预冷的异丙醇，混匀后置于4℃沉淀 1h或-20℃30min; g) 10000rpm离心10min; h) 弃上清液，沉淀用70%乙醇洗涤3次，自然晾干； i) 加入100uLddH20，1uLRNAase，37℃水浴30min； j) 待充分溶解后，用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度和纯度；DNA原液-20℃保存备用。 注：以上为推荐的一种DNA提取方法。所获DNA质量能够符合PCR扩增需要的DNA提取方法都适用于本标准。 2 DB64/T1203—2016 9.3PCR扩增 9.3.1SSR引物 使用的特定引物及其序列见附录C。 9.3.2反应体系 9.3.2.1利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测时，PCR反应体系为20μL，包括20ng~50ng基因组DNA， TaqDNA聚合酶1.0U，10×PCR缓冲液2μL，dNTP0.2mmo1/L，正向引物和反向引物各0.3μumo1/L， 剩余体积用超纯水补足至20μL。 9.3.2.2利用毛细管电泳检测时，PCR反应体系为20μL，包括20ng~50ng基因组DNA，TaqDNA聚合 酶1.0U，10×PCR缓冲液2μL，dNTP0.2mmo1/L，M13荧光标记引物和反向引物各0.4μmo1/L，正向 引物0.4μumo1/L，剩余体积用超纯水补足至20μL。 9.3.3反应程序 9.3.3.1变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测时，PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30S，58℃ ~60℃（根据附录C引物退火温度设定）退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸5min， 4℃保存。 录C引物退火温度设定）30，72℃延伸30S，共30个循环；94℃变性30S，53℃退火30，72℃延 伸30s，10个循环；72℃延伸5min，4℃保存。 9.4PCR扩增产物检测 9.4.1变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）与银染检测 9.4.1.1清洗玻璃板 用去污剂和清水将玻璃板洗涤干净并晾干。用无水乙醇擦洗2遍，吸水纸擦干。小玻璃板用1mL 剥离硅烷处理，大玻璃板用2mL预混的亲和硅烷工作液处理。操作过程中防止两块玻璃相互污染。 9.4.1.2组装电泳板 将两块玻璃板晾干，以0.4mm的边条置于大玻璃板左右两侧，将小玻璃板压于其上并固定，用胶条 封住底部，在两块玻璃板两侧在有边条处用夹子夹住，注意间距。 9.4.1.3灌胶 按附录B配置60mL6%的变性PAGE胶溶液，轻轻混匀后灌胶。灌胶过程中防止出现气泡。待胶液 充满玻璃夹层，将0.4mm厚鲨鱼齿梳平齐端向里轻轻插入胶液约0.5cm处。室温下聚合1h以上。待 胶聚合后，清理胶板表面溢出的胶液，轻轻拔出梳子，用清水洗干净备用。 9.4.1.4预电泳 正极槽（下槽）中加入1×TBE缓冲液（没过下槽高度的80%），在负极（上槽）加入1XTBE缓冲 液（没过短玻璃板上端1cm），60W恒功率预电泳30min。 3