ICS 67.160.60 X62 DB64 宁夏回族自治区地方标准 DB 64/ T 1511—2017 葡萄及葡萄酒中花色苷的测定 高效液相色谱法 2017-11-01 发布 2018-02-01实施 宁夏回族自治区质量技术监督局 发布 DB64/T 1511—2017 前 言 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规划起草。 本标准由宁夏农林科学院提出。 本标准由宁夏葡萄产业发展局归口。 本标准起草单位：宁夏农产品质量标准与检测技术研究所、宁夏农林科学院。 本标准参加起草单位：宁夏国有林场和林木种苗工作总站、西北农林科技大学食品科学与工程学院、 中卫市农产品质量安全检验检测中心。 本标准主要起草人：葛谦、刘冰、路洁、赵子丹、陈杭、牛艳、张艳、王晓菁、袁亚宏、吴燕、张 锋锋、苟春林、陈翔、魏晓琴。 DB64/ T 1511—2017 葡萄及葡萄酒中花色着的测定高效液相色谱法 1范围 本标准规定了高效液相色谱法测定葡萄及葡萄酒中飞燕草色素、矢车菊色素、矮牵牛色素、天竺葵 色素、芍药色素和锦葵色素的测定方法，其中包括原理、试剂和材料、仪器与设备、分析步骤、结果计 算及精密度。 本标准适用于葡萄和葡萄酒中6种花色苷的测定。 本标准的方法检出限：矮牵牛色素、锦葵色素的检出限均为0.040mg/kg，矢车菊色素、药色素、 飞燕草色素、天竺葵色素检出限均为0.020mg/kg。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义。 GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复性与 再现性的基本方法。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法。 3原理 试样经过乙醇+盐酸+水（2+1+1，V/V）的强酸溶液超声波萃取后，经沸水浴中加热1小时，将结构 稳定的花色苷水解成花青素，用高效液相色谱法测定，以保留时间定性，峰面积外标法定量。 4试剂和材料 除非另有规定，本法所使用试剂均为分析纯。水为GB/T6682规定的一级水。 4.1无水乙醇（C2H50H）：色谱纯。 4.2甲醇（CH3OH）：色谱纯。 4.3磷酸（H2PO3）：优级纯。 4.4盐酸（HC1）：优级纯。 4.5提取液：无水乙醇+水+盐酸（2+1+1，V/V），取200mL无水乙醇、100mL水和100mL盐酸混匀。 4.610%盐酸甲醇溶液（V/V）：取10mL盐酸、90mL甲醇混匀。 4.7飞燕草色素（Delphinidin）：CAS号528-53-0，纯度≥96%。 4.8矢车菊色素（Cyanidin）：CAS号528-58-5，纯度≥98%。 4.9矮牵牛色素（Petunidinchloride）：CAS号1429-30-7，纯度≥96%。 1 DB64/ T 1511—2017 4.10天竺葵色素（Pelargonidin）：CAS号134-04-3，纯度≥96%。 4.11药色素（Peonidin）：CAS号134-01-0，纯度≥98%。 4.12锦葵色素（Malvidin）：CAS号643-84-5，纯度≥96%。 4.13单标储备溶液 分别准确称取飞燕草色素、矢车菊色素、矮牵牛色素、天竺葵色素、芍药色素和锦葵色素共6种花 储备液，于-18℃～-20℃下，贮存于密闭的棕色玻璃瓶中保存，有效期为6个月。 4.14混合标准使用液 在使用中将单标储备溶液进行混合后，用10%盐酸甲醇溶液（4.6）作为溶剂，并逐级稀释成0.5mg/L、 2.0mg/L、5.0mg/L、10.0mg/L、50.0mg/L、80.0mg/L、100.0mg/L的花色苷混合标准使用液。0℃~5℃冰 箱密封保存，有效期为3个月。 4.15微孔滤膜：0.45μm，水相滤膜。 5仪器与设备 5.1高效液相色谱仪（HPLC）：配有紫外检测器。 5.2水浴锅（精度：±1℃）。 5.3超声波清洗机。 5.4超纯水机。 5.5分析天平：感量±0.001g。 5.6组织捣碎机。 6分析步骤 6.1试样制备 葡萄样品取可食部分缩分后，用组织捣碎机将其匀浆并取样，-18℃~-20℃条件下保存备用。葡萄 酒样品取样前将其混匀，0℃~5℃条件下保存备用。 6.2提取 葡萄样品称取10g（精确至0.001g），葡萄酒样品吸取5.00mL，于100mL三角瓶中，加入提取液（4.5） 25mL，盖上瓶塞将其摇匀1min，超声萃取30min。 6.3水解 将超声萃取后的提取液，于沸水浴中冷凝回流水解1h，取出将其冷却静置，取上清液，用0.45μm 水相滤膜过滤，待测。 2 DB64/T 1511—2017 6.4测定 6.4.1 色谱参考条件 a) 色谱柱：Agilent-ZORBAXSB-C18色谱柱（4.6mmx250mm，5um）或性能相当者； b) 流动相：A为乙：B为含0.1%磷酸水溶液； c) 柱温：40℃； (P 检测波长：525nm； e) 进样体积：5uL； f) 梯度洗脱条件，见表1。 表1梯度洗脱表 时间，min 流速，mL/min 流动相A，% 流动相B，% 0 0. 8 10 90 25. 0 0.8 25 75 25.1 0. 8 10 06 6.4.2 标准曲线的绘制 将混合标准使用液（4.14）依次由低浓度到高浓度进样检测，分别以质量浓度X(mg/L)为横坐标， 响应值Y（峰面积）为纵坐标，进行线性回归，得到6种花色苷标准曲线回归方程。 6.4.3试样测定 在相同色谱条件下，将待测液注入液相色谱仪中，以保留时间定性，根据峰面积采用外标法定量。依 据标准曲线回归方程计算待测液中6种花色苷的浓度。响应值应在标准曲线范围内，超过线性范围则应 稀释后再进样分析。 7 结果计算 样品中花色苷总含量为6种花色素含量之和。葡萄样品按式（1）计算；葡萄酒按式（2）计算。 pxV (1) m 式中： @一各花色苷总含量，单位为（mg/kg）； o一待测液中各花色苷的质量浓度，单位为毫克每升（mg/L）； Vi一提取体积，单位为毫升（mL）； m一试样质量，单位为克（g）。 pxy (2) V2 式中： 一各花色苷总含量，单位为（mg/L）； 3