ICS 65.020.20 B05 DB64 宁夏回族自治区地方标准 DB 64/T 728--2011 马铃薯脱毒快繁技术规程 2011-12-18实施 2011 - 12 -18 发布 发布 宁夏回族自治区质量技术监督局 DB64/T 728—2011 前 言 本标准的编写格式符合GB/T1.1-2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写》的要求。 本标准由北方民族大学提出。 本标准由宁夏回族自治区农牧厅归口。 本标准由北方民族大学起草。 本标准主要起草人：曹君迈、陈彦云、郭荣、陈建荣、张欣、王薇、贝盏临、雷茜、祁金涛、冯佩、 马登华。 DB64/T728-2011 马铃薯脱毒快繁技术规程 1范围 本标准规定了马铃薯脱毒快繁技术规程的术语定义、母株选择、入选材料病毒初检、培养基的配制、 外植体的制备及置床、再生植株的形成及的病毒检测、再生植株的扩繁、终检及无毒苗的扩繁。 本标准适用于马铃薯脱毒快繁的生产管理与操作。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB18133马铃薯脱毒种薯 3术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3. 1 脱毒苗 选用分生组织做外植体通过植物组织培养技术获得的再生试管苗，经检测符合GB18133病毒检测要 求。 3.2 植物组织培养 在适宜的人工培养基上和无菌条件下对植物离体器官、组织或细胞（包括原生质体)进行培养，使之 诱发产生组织或者长成完整植株的一种实验技术。 3. 3 分生组织 具有细胞分裂能力的植物细胞群。 3. 4 外植体 用来进行无菌培养的离体材料。 注：可以是器官、组织、细胞和原生质体或用于继代培养的组织培养物。 3.5 DB64/T728—2011 继代培养 初代培养产物转入继代培养基上，使愈伤组织分化出丛生芽、不定芽继续增殖、胚状体发育成完整 植株的过程。 3. 6 组培快繁 在较短的时间内，利用植物组织培养技术生产出大量的优质种苗。 母株选择 4.11 以茎尖为脱毒材料的取材方法 对确立要脱毒的马铃薯品种，进行田间种植观察。在开花期，选择生长健壮，具有本品种典型特征、 特性的单株做为初选材料挂牌，收获后对其经济性状表现优良的薯块，做为入选材料。 4.2以芽尖为脱毒材料的取材方法 对确立要脱毒的马铃薯品种，进行田间种植观察。在始花期，选择生长健壮，具有本品种典型特征、 特性的单株做为初选材料挂牌，并在晴天温度较高时，每株取30个约1cm长的芽尖，依次编号，放入保鲜 盒内，带入实验室进行检测。 5入选材料病毒初检 5.1以茎尖为脱毒材料的初检 对入选材料，按GB18133的规定先进行PSTVd检测，随后进行其它病毒的检测，对无规定病毒种类的 材料入选进入下程序。 5.2以芽尖为脱毒材料的初检 对所取的材料留芽尖0.5cm长部位备用，其余部分按GB18133的规定进行病毒检测，对未规定病毒 种类的材料入选进入下一程序。 6培养基的配制 6.1培养基母液的配制 按表1要求配制培养基母液。 表1 MS培养基母液的配置 标准用量 母液定容体积 1升培养基吸 母液编号 化合物名称 扩大倍数（倍） 称取量（mg） (mg/L) (ml) 取量（ml） 100 5种盐分别充 KNO: 1900 190000 母液1 分溶解后混合 10 NH,NO. 1690 100 169000 定溶至1000ml 2 DB64/ T 728--2011 表1(续) 标准用量 母液定容体积 1升培养基吸 母液编号 化合物名称 扩大倍数（倍） 称取量（mg） (ml) 取量（ml) (mg/L) KH,PO, 170 100 17000 5种盐分别充 母液1 分溶解后混合 10 MgSO.. 7H20 370 100 37000 定溶至1000ml CaC12. 2H:0 440 100 44000 MnSO4.4HO 22.3 100 2230 ZnSO. 7H20 8.6 100 860 6. 2 100 620 7种盐分别充 H.BO. 母液2 83 分溶解后混合 10 KI 0.83 100 定溶至1000ml Na.Mou. 2H0 0.25 100 25 CuS0.. 5H20 0.025 100 2. 5 CoCl. 6H0 0.025 100 2. 5 Na.-EDTA 37.3 100 3730 2种盐分别充 母液3 分溶解后混合 10 FeSO. 7H.0 27. 0 100 2780 定溶至1000ml 甘氨酸 2 100 200 4种有机物分 盐酸硫胺素VBt 0. 1 100 10 母液4 别溶解后再定 10 盐酸吡哆醇VB 0. 5 100 50 溶至1000ml 烟酸 0. 5 100 50 6.2 培养基母液的保存 配制好的母液分别贴上标签，注明母液名称、扩大倍数或浓度、日期，存于冰箱4℃保存备用。母 液出现霉变或沉淀时，不再使用。 6.3培养基配制 按每升培养基分别量取表1中的各种母液，放入烧杯中备用；称取卡拉胶5g/L、食用白糖25g/L，放 入不锈钢锅中，加入所需培养基体积量的2/3的水，煮沸至清澈透明；将烧杯中的混合母液加入不锈钢 锅中定容；用精密pH试纸或pH测定仪测pH值后，用1molHC1或1mo1NaOH将培养基pH值调至5.6～6.0。 6.4培养基灭菌 将配好的固体培养基，每瓶装30mL～40mL，封紧瓶口，放入高压灭菌筐内，121℃灭菌，压强为 0.105MPa下高压蒸气灭菌20min。灭菌结束后，取出培养瓶，贴好标签，放入无菌室备用，一般14d内用 完。 7外植体的制备及置床 7.1以茎尖为脱毒材料的外植体制备 7.1.1热处理 3 DB64/T 728—2011 将入选的单株块茎发芽后，放置光照培养箱内，进行热处理，温度37℃，处理时间为3～6周，以脱 除马铃薯卷叶病毒(PLRV) 7.1.2培养材料的消毒 7.1.2.1取1cm长经热处理块茎的顶芽、侧芽放于烧杯中，用纱布盖好，流水下冲洗0.5h～1h，送 入无菌超净工作台，75%乙醇（v/v）浸泡15s左右，无菌水冲洗1次，然后在10%NaC10(v/v）溶液中灭菌 8min10min，倒掉灭菌液，迅速倒入无菌水，反复冲洗2次～3次；或用0.1%升汞（w/v）浸泡6min~ 7min，倒掉灭菌液，迅速倒入无菌水，反复冲洗4次5次，放在带盖的无菌水瓶中备用。 7.1.2.2无菌室、超净工作台面清理干净后，用75%乙醇消毒。将高温灭菌的操作工具镊子、手术剪 等放入工作台，打开台内和室内紫外灯照射20min。 7.1.3茎尖剥离及置床 在超净工作台上，将茎芽置于双筒解剖镜（4×10）下，用灭菌的解剖针去掉幼叶，直至露出半圆 形光滑生长锥，剥取0.1mm～0.3mm的茎尖（带1个叶原基），接种于预先配制好加有激素的MS培养基的 试管中，每支试管中接种2个茎尖，将试管口在洒精灯外火焰上转动烘烤灭菌，封口，在管上注明品种 （品系）名称，处理编号和接种日期。、 7.2以芽尖为脱毒的外植体制备与置床 7.2.1培养材料的消毒 对入选的芽尖，放入广口瓶中，用纱布盖好，酌情用水冲洗干净后，先倒入70%酒精，摇动6S~ 7s，立即将酒精倒出，再倒入0.1%氯化汞液或次氯酸钠，浸泡4min～8min；浸泡过程中不断摇动，然 后在接种台上用灭菌蒸馏水洗3次～4次，放在带盖的无菌水瓶中备用。无菌室、超净工作台面清理干净 后，用70%乙醇消毒，将高温灭菌的操作工具镊子、手术剪等放入工作台，打开台内和室内紫外灯照射 20min。 7.2.2外植体制备与置床 在超净工作台上，将叶芽置放在灭菌的培养血中，切成1mm～3mm长的外植体，接于预先配制好加有激 素的MS培养基中，每瓶接种4个芽尖，盖好瓶盖，贴好标签，注明品种（品系）名称，处理编号和接种日 期。 8再生植株的形成及病毒检测 8.1外植体的诱导培养 将装有外植体的培养皿送入培养室或培养箱培养。培养条件：光强10001ux～25001ux，光周期8h 光/16h暗，当光过强时，拉上窗帘以降低自然散射光的光照强度，当光照强度不足时利用日光灯补充光 照。温度为25°C士2°C，培养40d～60d。随时剔除污染株，做好记录，见附录A中表A.1。 8.2外植体的分化及继代培养 茎尖培养40d～60d，转入无激素培养基，5个月左右，便可形成小植株。随时剔除污染株，做好记录， 见附录A中表A.1。繁殖20瓶时，进行病毒检测，其培养条件：光强29001ux～46001ux，光周期12h光/12h 暗，当光过强时，拉上窗帘以降低自然散射光的光照强度，当光照强度不足时可利用日光灯补充光照。 温度为23°C土2°C，培养12d～20d。随时剔除污染株，做好记录，见附录A中表A.2。 4 DB64/ T 728—-2011 8.3再生植株的病毒检测 扩繁试管苗按2%的比率取样，按GB18133的规定进行病毒检测，对有病毒瓶苗应进行淘汰，无毒苗 扩繁。 9再生植株的扩繁 9.1灭菌及接种 9.1.1将消毒好的接种用具、培养基等置于接种台上，打开超净台开关，开机30min。同时，打开工 作台上的紫外灯及接种室的紫外灯，灭菌20min。 9.1.2工作人员接种前用肥皂洗手，特别是将手指洗净，穿好工作服，然后用沾以70%酒精的棉球把 手和指尖消毒1次。用70%酒精棉球把接种台面擦1遍清除尘粒，将接种所用的镊子等，沾以70%酒 精，在酒精灯火焰上，灼热灭菌。灭菌后放在消毒过