书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 犛 犖／犜２ ４ ８ ５—２ ０ １ ０ 植物病毒脱除处理规程 犚 狌 犾 犲 狊狅 犳 狆犾 犪 狀 狋狏 犻 狉 狌 狊犲 犾 犻 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀 ２ ０ １ ００ ３０ ２发布 ２ ０ １ ００ ９１ ６实施 中 华 人 民 共 和 国 国家质量监督检验检疫总局发 布 rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.书书书前　　言 　　本标准附录 Ａ为资料性附录 。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口 。 本标准负责起草单位 ：中国检验检疫科学研究院 。 本标准参与起草单位 ：中华人民共和国云南出入境检验检疫局 ，华中农业大学 ，天赐花卉公司 。 本标准主要起草人 ：李明福、王仁睿、黄新、王国平、丁元明、潘利军、马洁。 本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准 。 Ⅰ犛 犖／犜２ ４ ８ ５—２ ０ １ ０ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.植物病毒脱除处理规程 １　范围 本标准规定了植物脱毒处理程序方法 。 本标准适用于检验检疫行业 、农林业对带有病毒的植物繁殖材料的无毒无害化处理 。 ２　术语和定义 下列术语和定义适用于本标准 。 ２．１ 病毒　狏 犻 狉 狌 狊 病毒是肉眼不可见 ，依赖于寄主细胞复制 ，其基因组核酸外包裹着外壳蛋白的一类专性寄生的特殊 微生物。 ２．２ 病毒脱除处理 　狏 犻 狉 狌 狊犲 犾 犻 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀 应用物理 、化学、生物学等方法 ，祛除植物所感染的病毒 ，使之无毒无害化的过程 。 ２．３ 组织培养 　狆犾 犪 狀 狋 狋 犻 狊 狊 狌 犲犮 狌 犾 狋 狌 狉 犲 在无菌条件下 ，将离体的植物器官 、组织、细胞以及原生质体等繁殖材料 ，培养在人工培养基上 ，并 在人工控制的环境下生长 、分化、增殖至再生植株的过程 。 ２．４ 茎尖培养 　狊 犺 狅 狅 狋犪狆犻 犮 犲 狊犮 狌 犾 狋 狌 狉 犲 在无菌条件下剥取植物茎尖 （顶端分生组织带 １个～２个幼叶原基 ） ，在人工控制的条件下分化再 生的方法 。 ２．５ 热处理　狋 犺 犲 狉 犿 狅 狋 犺 犲 狉 犪 狆 狔 植物材料置于适当的隔离设施 （如：恒温恒湿箱 、日光温室 ）中，在不同的高温条件下 ，持续处理一定 的时间（几周或数月 ） ，以钝化植物中的病毒或降低其浓度 。 ２．６ 化学处理 　犮 犺 犲 犿 狅 狋 犺 犲 狉 犪 狆 狔 在植物培养基中添加一定浓度的化学物质 ，抑制或干扰植物组织中的病毒复制或繁殖 。 ３　原理 ３．１　处理原则 针对检验检疫或生产中发现植物携带管制的病毒时 ，一般可进行销毁处理 。如因植物珍贵或应客 户需求，需针对管制的病毒实施脱除处理 。 ３．２　病毒脱除处理 针对植物病毒在植物体内分布不均匀 、植物病毒复制过程需要特殊酶或物质参与 ，植物病毒外壳蛋 白受热钝化等特点 ，设计茎尖组织培养 、化学治疗和物理治疗 ，以脱去病毒 。 １犛 犖／犜２ ４ ８ ５—２ ０ １ ０ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.４　仪器和用具 ４．１　仪器 ４．１．１　超净工作台 。 ４．１．２　天平（０． ０ ０ １ｇ） 。 ４．１．３　解剖镜。 ４．１．４　光照培养箱 。 ４．１．５　恒温恒湿箱 。 ４．１．６　高温灭菌锅 。 ４．２　用具 ４．２．１　量筒。 ４．２．２　容量瓶。 ４．２．３　接种针或解剖刀 。 ４．２．４　镊子。 ４．２．５　ｐＨ计或ｐＨ试纸。 ５　病毒检测方法 ５．１　生物学检测 （指示植物法 ） 。 ５．２　酶联免疫法 。 ５．３　ＲＴ  Ｐ Ｃ Ｒ 方法。 ５．４　核酸杂交方法 。 ６　植物病毒脱除处理程序 ６．１　病毒脱除方法 ６．１．１　材料剪取与灭菌 在超净工作台上剪取植株茎尖 １ｃ ｍ～２ｃ ｍ，自来水冲洗 ３ ０ｍ ｉ ｎ，剥去外面的叶片 ，将茎尖置于超净 工作台上 ，无菌条件下进行消毒 ：７ ５％的乙醇浸泡 １ ０ｓ，已灭菌的蒸馏水冲洗 ３次～５次，０． １％的升汞 浸泡，加入１滴～２滴吐温，消毒５ｍ ｉ ｎ～１ ５ｍ ｉ ｎ，已灭菌的蒸馏水冲洗 ３次～５次，每次２ｍ ｉ ｎ～３ｍ ｉ ｎ。 ６．１．２　茎尖剥离与接种 把经过上一步消毒处理后的茎尖放在解剖镜下 ，用已灭菌的接种针或解剖刀逐层剥去幼叶 ，直至出 现顶端分生组织 ，将顶端分生组织和毗邻的 １个～２个叶原基切下 ，直立向上接种到适宜的固体培养 基上。 ６．１．３　热处理结合茎尖培养 将供试材料放入恒温恒湿箱 （温度范围 ：３ ０℃～４ ０℃） ，日夜变温处理几天至几月 。热处理后的材 料按照上述茎尖剥离与接种步骤进行培养 ，参见附录 Ａ。 ６．１．４　化学治疗结合茎尖培养 筛选对病毒有抑制作用的化学药剂 ，如病毒唑 、硫脲嘧啶等 ，浓度常为 １ ０ｍｇ／Ｌ～３ ０ｍｇ／Ｌ，添加到 培养基中 ，培养一月至几月 ，然后再按照上述茎尖剥离与接种步骤进行培养 ，参见附录 Ａ。 ６．２　试管苗的病毒检测 用上述病毒的检测方法检测试管苗 ，如果检测结果为阴性则初步定为脱病毒试管苗 ，进行后期的扩 繁和生根移栽 ，如果检测结果为阳性则不是脱病毒试管苗 ，需要进一步进行病毒脱除处理 。 ２犛 犖／犜２ ４ ８ ５—２ ０ １ ０ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.６．３　试管苗的扩繁与生根培养 ６．３．１　试管苗的扩繁 检测结果为阴性的试管苗可接种到扩繁培养基上进行增殖 。 ６．３．２　生根培养 试管苗长至 ３ｃ ｍ～５ｃ ｍ时转至生根培养基进行培养 。 ６．４　试管苗的驯化 将生长茁壮 、有３片～５片叶的试管苗移至温室进行炼苗 。 ６．５　移栽 ６．５．１　过渡培养 取出试管苗 ，洗净根部培养基 ，移入适宜的栽培基质中 ，刚移栽的试管苗要避光 ，湿度：８ ５％，温度： 白天２ ５℃～２ ８℃，夜间１ ５℃～１ ８℃。避光保湿培养 ２ｄ～３ｄ后在正常的光照 、温湿度条件下进行 培养。 ６．５．２　移入土壤 过渡培养 ２周后，将生长茁壮的植株移入土壤 。 ６．６　移栽后植株的病毒复检 移栽后的脱病毒植株长到一定大小需要进行病毒复检 ，若复检结果与第一次结果相同 ，均为阴性 ， 则可认定为脱病毒苗 ；若复检结果与第一次结果不同 ，为阳性，则再生苗不是脱毒苗 ，需要进一步进行病 毒脱除处理 。 ６．７　扩大繁殖 经过上述过程 ，进行两次病毒检测的无病毒植株作为健康母株 ，进行扩大繁殖 ，完成整个病毒脱除 处理过程 。 ３犛 犖／犜２ ４ ８ ５—２ ０ １ ０ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.附　录　犃 （资料性附录 ） 常见病毒脱毒方法 表犃．１　常见病毒脱毒方法 病毒名 寄主 脱毒方法 百合潜隐病毒 Ｌ Ｓ Ｖ 黄瓜花叶病毒 ＣＭＶ 郁金香碎花病毒 Ｔ Ｂ Ｖ 异名百合斑驳病毒 ＬＭｏ Ｖ 百合丛簇病毒 Ｌ ＲＶ百合热处理结合茎尖培养 ：热处理：４ ０℃处理５ｄ后剥取茎尖 ，茎尖带１个～ ２个叶原基 ，即０． ２ｍｍ ～０． ５ｍｍ ，尽量少带邻近组织 菊花Ｂ病毒ＣＶ Ｂ 番茄不孕病毒 ＴＡＶ 菊花花叶病毒 Ｃ ｈＭＶ 马铃薯Ｙ病毒Ｐ ＶＹ 马铃薯Ｘ病毒Ｐ ＶＸ 烟草花叶病毒 ＴＭＶ 黄瓜花叶病毒 ＣＭＶ菊花（１）热处理结合茎尖培养 ：盆栽苗在白天 ４ ０℃、夜间３ ０℃条件下处理 １ ０ｄ～２ ０ｄ。再进行剥取茎尖 ，茎尖带１个～２个叶原基 。 （２）化学药剂结合茎尖培养 ：在培养基上添加 ８ 氮鸟嘌呤 、硫脲嘧啶 、 病毒唑，浓度范围为 １ ０ｍｇ／Ｌ～２ ０ｍｇ／Ｌ，培养４周后剥取茎尖 建兰花叶病毒 ＣｙＭＶ 齿兰环斑病毒 ＯＲ Ｓ Ｖ兰花化学药剂结合茎尖培养 ：原球茎顶端分生组织先在病毒唑中浸泡 １ ５ｍ ｉ ｎ，然后转接到添加病毒唑的培养基上 ，浓度范围为 ２ ０ｍｇ／Ｌ～ ３ ０ｍｇ／Ｌ，暗培养４周，转到不含病毒唑的培养基中进行原球茎增殖 马铃薯Ｘ病毒Ｐ ＶＸ 马铃薯Ｙ病毒Ｐ ＶＹ 马铃薯Ａ病毒Ｐ ＶＡ 马铃薯Ｍ病毒Ｐ ＶＭ 马铃薯Ｓ病毒Ｐ Ｖ Ｓ 马铃薯卷叶病毒 Ｐ Ｌ ＲＶ 马铃薯帚顶病毒 ＰＭＴＶ马铃薯（１）热处理结合茎尖培养 ：将块茎放在 ２ ５ ℃条件下发芽 ，当芽长到 ０． ５ｃ ｍ～１ｃ ｍ后放置在光照培养箱内 ，进行热处理 ，白天３ ６℃、１ ６ｈ， 晚上３ ０℃、８ｈ，处理时间为 ３周～４周，剥取茎尖 。 （２）化学药剂结合茎尖培养 ：在培养基上添加 ８ 氮鸟嘌呤 、硫脲嘧啶 、 病毒唑，浓度范围为 １ ０ｍｇ／Ｌ～２ ０ｍｇ／Ｌ，培养４周后剥取茎尖 苹果褪绿叶斑病毒 ＡＣ Ｌ Ｓ Ｖ 苹果茎沟病毒 Ａ Ｓ ＧＶ 苹果茎痘病毒 Ａ Ｓ Ｐ Ｖ 苹果花叶病毒 ＡｐＭＶ 苹果锈果类病毒 Ａ Ｓ Ｓ Ｖ ｄ苹果（１）热处理结合茎尖培养 ：ａ）盆栽苗热处理 ：在白天温度 ２ ０℃～２ ３℃， 夜间１ ３℃培养，待接穗发芽长出 ３片～５片叶时移入热处理箱内 ，首 先在２ ５℃～３ ０℃下处理１ ４ｄ，然后将温度调至 ３ ７℃±１℃ ，恒温处理 ２ ８ｄ，处理后剥取茎尖 ；ｂ）组培苗热处理 ：３ ７℃，培养３ ０ｄ；置３ ２℃恒 温培养箱培养 １周，然后升温至 ３ ７℃热处理２ ０ｄ～５ ０ｄ后剥取茎尖 ； （２）化学药剂结合茎尖培养 ：培养基中分别添加板蓝根和病毒唑 ，浓度 范围为１ ０ｍｇ／Ｌ～４ ０ｍｇ／Ｌ，培养６周后剥取茎尖