SN-T 2849-2011 进出境牛传染性胸膜肺炎检疫规程

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖／犜２８４９—２０１１进出境牛传染性胸膜肺炎检疫规程犙狌犪狉犪狀狋犻狀犲狆狉狅狋狅犮狅犾狅犳犮狅狀狋犪犵犻狅狌狊犫狅狏犻狀犲狆犾犲狌狉狅狆狀犲狌犿狅狀犻犪犳狅狉犻犿狆狅狉狋犪狀犱犲狓狆狅狉狋犫狅狏犻狀犲２０１１０２２５发布２０１１０７０１实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布 rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.书书书前　　言　　本标准按照ＧＢ／Ｔ１．１—２００９给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局。本标准主要起草人：简中友、李叶、马贵平、史喜菊、贾赟、胡传伟、苏永生、孙颖杰。 Ⅰ犛犖／犜２８４９—２０１１ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.进出境牛传染性胸膜肺炎检疫规程１　范围本标准规定了牛传染性胸膜肺炎（ｃｏｎｔａｇｉｏｕｓｂｏｖｉｎｅｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａ，ＣＢＰＰ）诊断技术要求。本标准适用于进出境牛传染性胸膜肺炎检疫、诊断及流行病学调查。２　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。２．１　牛传染性胸膜肺炎　犮狅狀狋犪犵犻狅狌狊犫狅狏犻狀犲狆犾犲狌狉狅狆狀犲狌犿狅狀犻犪；犆犅犘犘牛传染性胸膜肺炎（ＣＢＰＰ）也称牛肺疫，是由丝状支原体引起牛的一种接触性传染病，主要侵害牛的肺和胸膜，其病理特征为纤维素性或浆液纤维素性肺炎、胸膜炎。３　缩略语下列缩略语适用于本文件。ＣＢＰＰ（ｃｏｎｔａｇｉｏｕｓｂｏｖｉｎｅｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａ）：牛传染性胸膜肺炎Ｃ  ＥＬＩＳＡ（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅｅｎｚｙｍｅｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ）：竞争酶联免疫吸附测定法ＣＦＴ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｆｉｘａｔｉｏｎｔｅｓｔ）：补体结合试验４　流行病学、临床及病理诊断４．１　流行病学在自然条件下，本病主要感染牛等反刍动物，如黄牛、牦牛、水牛、犏牛、奶牛，其中３岁～７岁的牛多发，犊牛少见。４．２　临床症状急性型：呈急性胸膜肺炎症状，体温升高，热型为稽留热。呼吸困难，气喘，呈腹式呼吸，频发咳嗽，流浆液性或脓性鼻液。胸部叩诊呈浊音或水平浊音，听诊肺泡音弱或消失，出现罗音、支气管呼吸音和胸膜摩擦音。后期可见胸前皮下和肉垂水肿。病牛迅速消痩，常窒息死亡。慢性型：病牛消痩，偶发干性咳嗽，胸部听诊和叩诊无明显变化。４．３　病理特点本病的特征病变主要在肺和胸腔。发病初期，多见炎性浸润，以小叶性支气管炎为特征，小叶呈灰红色局灶性充血或炎性水肿。随病程发展，多数呈典型的浆液性纤维素性胸膜肺炎、胸膜炎，一侧的膈叶和中间叶高度肿大，质度坚实如肝脏，肺肝变，常见互相镶嵌的暗红色、灰红色乃至灰黄色的肝变同时存在，外观呈大理石花纹。病程较长者，病变部的肺组织发生肉变和坏死，坏死灶被结缔组织包围，进一步形成空洞或瘢痕。１犛犖／犜２８４９—２０１１ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.有些病例的胸腔积液呈淡黄色透明或纤维素絮状物（或絮片），严重病例发生肺与胸膜黏连。纵隔淋巴结和支气管淋巴结显著肿大，切面多汁，呈黄白色，并有坏死灶。５　病原分离与鉴定本试验应在生物安全 Ⅲ级及以上实验室进行。５．１　材料准备５．１．１　器材：组织匀浆器、培养皿、小试管、玻片、染色缸、接种环、二氧化碳培养箱、普通显微镜。５．１．２　培养基和试剂：１０％马血清马丁肉汤、普通１０％马血清马丁琼脂、葡萄糖生化培养基、精氨酸生化培养基、四氮唑盐生化培养基、５％铬酸水溶液、姬姆萨氏染液，配制方法见Ａ．１～Ａ．７。５．２　样品采集和送检无菌采取病牛鼻腔分泌物或胸腔积液、血液和关节滑液，或剖检时采取肺脏病变组织、肺门淋巴结和胸腔渗出液，置于含运输培养基的灭菌容器中，以冷藏状态立即送实验室检疫。不能立即送检的，应置－２０℃低温保存。５．３　样品处理胸腔液、血液和关节滑液可直接用作接种材料。组织样品匀浆后，用含５００ＩＵ／ｍＬ青霉素及１∶７０００乙酸铊的肉汤１０倍稀释，置于４℃过夜，即为接种样品液。５．４　样品接种５．４．１　用灭菌吸管吸取０．１ｍＬ～０．３ｍＬ样品液，无菌接种于５管１０％马血清肉汤培养基中，３７℃培养１０ｄ。５．４．２　用无菌接种环钓取样品液在１０％马血清肉汤琼脂平板上划线接种，每个样品接种５个平板。平板用胶布封口，倒置于５％二氧化碳培养箱中３７℃培养１０ｄ。５．５　观察５．５．１　从接种后第３ｄ开始直至第１０ｄ，每天观察接种管及平板生长情况。５．５．２　在１０％马血清肉汤试管中，牛传染性胸膜肺炎病原的生长表现为：初期呈轻微浑浊或白色点状或丝状，后逐渐均匀浑浊，呈半透明稍带乳光，无菌膜或沉淀，也无颗粒悬浮。５．５．３　在１０％马血清肉汤琼脂培养基上，牛传染性胸膜肺炎病原的生长表现为：生长缓慢，为水滴状圆形略带灰色的微小菌落，中央有乳头状突起，呈“煎蛋”样外观，菌落直径约为０．２ｍｍ～０．５ｍｍ，小的不易看见，需用放大镜或低倍显微镜观察。５．５．４　将可疑菌落或可疑肉汤培养物接种于１０％马血清肉汤琼脂培养基上，３７℃培养３ｄ～４ｄ，连传三代进行纯化，供病原鉴定用。５．６　病原鉴定５．６．１　培养特性５．６．１．１　挑取菌落接种于１０％马血清肉汤培养基中，３７℃培养３ｄ～４ｄ，牛传染性胸膜肺炎病原的生长表现如５．５．２所述。２犛犖／犜２８４９—２０１１ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.５．６．１．２　挑取菌落接种在普通１０％马血清肉汤琼脂培养基上，３７℃培养３ｄ～４ｄ，牛传染性胸膜肺炎病原的生长表现如５．５．３所述。５．６．２　染色镜检挑取典型菌落，涂于玻片上，自然干燥，用５％铬酸水溶液固定２ｍｉｎ，水洗，浸入用蒸馏水稀释的１∶３０的姬姆萨氏染液中染色，４℃过夜，取出用蒸馏水清洗，自然干燥后用８００倍～１０００倍显微镜观察。牛传染性胸膜肺炎病原在显微镜下表现为多形态，以球形最常见，也可见杆状、丝状、环状、星状者，长度为１２５ｎｍ～２５０ｎｍ。５．６．３　生化试验挑取纯化菌落分别接种于葡萄糖生化培养基、精氨酸生化培养基和四氮唑盐生化培养基，３７℃培养３ｄ～５ｄ后观察结果。牛传染性胸膜肺炎病原能分解葡萄糖产酸变色但不产气；不能分解精氨酸，试管不变色；能还原四氮唑盐，培养基由无色变为红色。５．７　结果判定符合５．６．１、５．６．２和５．６．３所述条件的，判为牛传染性胸膜肺炎病原体分离鉴定阳性。６　微量凝集试验６．１　设备及器材微量移动液器，酶标反应板或微量滴定板（微量板）等。６．２　试剂稀释液为常规方法配制的０．８５％生理盐水；抗原、标准阳性血清、阴性血清按说明书使用。６．３　操作方法６．３．１　被检血清、标准阳性血清、阴性血清用灭菌生理盐水作１∶４稀释，５６℃～５８℃灭活３０ｍｉｎ。６．３．２　用灭菌生理盐水将抗原稀释至工作浓度。６．３．３　吸取被检血清２５μＬ，加入微量板的一个孔中。６．３．４　加工作量抗原２５μＬ于同一孔内，即每头份被检血清用一个孔。６．３．５　每板设阴、阳性血清和生理盐水对照。６．３．６　轻轻摇动反应板混匀，放室温暗处或４℃～８℃冰箱内５ｈ～２０ｈ左右。６．４　结果判定６．４．１　凝集程度： “＋＋＋＋ ”为１００％凝集， “＋＋＋”为７５％凝集， “＋＋”为５０％凝集， “＋”为２５％凝集， “－”为不凝集。６．４．２　判定方法：判定前轻轻振动反应板，静置３ｍｉｎ～５ｍｉｎ即行判定。判定时用８Ｗ日光灯照明，手持反应板，借助侧光在黑色背景上判定或用凝集反应箱观察。受检血清出现阳性反应的需重复试验一次，如两次结果不一致时，应再复试一次，以两次以上试验结果一致时为准。６．４．３　判定标准：在阴、阳性血清和生理盐水对照成立的情况下，被检血清出现 “＋＋”及以上凝集反应的判为阳性； “＋”和“－”为阴性反应。３犛犖／犜２８４９—２０１１ rHgCb@g · ykbûR60u5[PO 0SÑU.７　补体