书书书　 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 犛 犖／犜３ １ ９ ６—２ ０ １ ２ 水产品中致病性弧菌检测 全自动病原菌检测系统筛选法 犇 犲 狋 犲 狉 犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳 狆犪 狋 犺 狅犵犲 狀 犻 犮狏 犻 犫 狉 犻 狅犻 狀犪 狇狌 犪 狋 犻 犮狆狉 狅 犱 狌 犮 狋— 犃 狌 狋 狅 犿 犪 狋 犻 犮犱 犲 狋 犲 犮 狋 犻 狅 狀狊 狔狊 狋 犲 犿犳 狅 狉狊 犮 狉 犲 犲 狀 犻 狀 犵狆犪 狋 犺 狅犵犲 狀 犻 犮犫 犪 犮 狋 犲 狉 犻 犪 ２ ０ １ ２０ ５０ ７发布 ２ ０ １ ２１ １１ ６实施 中 华 人 民 共 和 国 国家质量监督检验检疫总局发 布 rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.书书书中华人民共和国出入境检验检疫 行　业　标　准 水产品中致病性弧菌检测 全自动病原菌检测系统筛选法 Ｓ Ｎ／Ｔ３ １ ９ ６—２ ０ １ ２  中 国 标 准 出 版 社 出 版 北京市朝阳区和平里西街甲 ２号（１ ０ ０ ０ １ ３） 北京市西城区三里河北街 １ ６号（１ ０ ０ ０ ４ ５） 总编室： （０ １ ０）６ ４ ２ ７ ５ ３ ２ ３ 网址ｗｗｗ． ｓｐｃ ． ｎ ｅ ｔ ． ｃ ｎ 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷  开本８ ８ ０×１ ２ ３ ０ １ ／１ ６　印张０． ５　字数９千字 ２ ０ １ ２年１ ０月第一版 　２ ０ １ ２年１ ０月第一次印刷 印数１—１６ ０ ０  书号：１ ５ ５ ０ ６ ６·２  ２ ４ ０ ８ ０ 　定价１ ４．０ ０元 rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.书书书前　　言 　　本标准按照 Ｇ Ｂ／Ｔ１． １—２ ０ ０ ９给出的规则起草 。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口 。 本标准起草单位 ：中华人民共和国福建出入境检验检疫局 、中华人民共和国湛江出入境检验检疫 局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局 、中华人民共和国宁波出入境检验检疫局 。 本标准主要起草人 ：邵碧英、郑晶、陈彬、黄晓蓉、陈春梅、劳华军、张体银、吴谦。 Ⅰ犛 犖／犜３ １ ９ ６—２ ０ １ ２ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.水产品中致病性弧菌检测 全自动病原菌检测系统筛选法 １　范围 本标准规定了水产品中霍乱弧菌 、副溶血性弧菌和创伤弧菌的筛选方法 。 本标准适用于水产品中霍乱弧菌 、副溶血性弧菌和创伤弧菌的快速筛选检测 。 ２　规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 。凡是注日期的引用文件 ，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件 ，其最新版本 （包括所有的修改单 ）适用于本文件 。 Ｇ Ｂ／Ｔ４ ７ ８ ９． ７ 　食品卫生微生物学检验 　副溶血性弧菌检验 Ｇ Ｂ／Ｔ６ ６ ８ ２　分析实验室用水规格和试验方法 Ｇ Ｂ／Ｔ２ ７ ４ ０ ３ 　实验室质量控制规范 　食品分子生物学检测 Ｓ Ｎ／Ｔ０ １ ７ ３　进出口食品中副溶血性弧菌检验方法 Ｓ Ｎ／Ｔ１ ０ ２ ２　进出口食品中霍乱弧菌检验方法 Ｆ ＤＡ／Ｂ ＡＭＣ ｈ ａ ｐｔ ｅ ｒ９　美国食品药品管理局 　微生物学分析手册 　第９章弧菌 ＮＭＫＬＮ ｏ． １ ５ ６ 　北欧食品协会 　食品中致病性弧菌定性和定量检测方法 ３　缩略语 下列缩略语适用于本文件 。 ３．１　ＤＮＡ（ｄ ｅ ｏ ｘｙｒ ｉ ｂ ｏ ｎ ｕ ｌ ｅ ｉ ｃａ ｃ ｉ ｄ ） ：脱氧核糖核酸 ３．２　Ｐ Ｃ Ｒ（ｐｏ ｌｙｍ ｅ ｒ ａ ｓ ｅｃ ｈ ａ ｉ ｎｒ ｅ ａ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ） ：聚合酶链式反应 ４　原理 Ｂ ＡＸ全自动病原菌检测系统是应用 Ｐ Ｃ Ｒ技术来检测病原菌 。反应所需的引物 、ＤＮＡ聚合酶和脱 氧核苷酸等被合并成为一个稳定 、干燥的片剂 ，并装入Ｐ Ｃ Ｒ管中。每个Ｐ Ｃ Ｒ试剂片都包含有荧光染 料，该染料能结合双链 ＤＮＡ，并且受光激发后发出荧光信号 。在检测过程中 ，Ｂ ＡＸ系统通过测量荧光 信号的变化 ，分析测量数据 ，从而进行结果判定 。 ５　试剂 ５．１　实验用水应符合 Ｇ Ｂ／Ｔ６ ６ ８ ２中一级水的规格 。 ５．２　碱性蛋白胨水 （Ａ ＰＷ） ，参见Ａ． １。 ５．３　Ｂ ＡＸ系统霍乱弧菌 ／副溶血性弧菌 ／创伤弧菌的 Ｐ Ｃ Ｒ检测试剂盒 ，２℃～８℃放置，参见Ａ． ２。 １犛 犖／犜３ １ ９ ６—２ ０ １ ２ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.６　仪器与设备 ６．１　恒温培养箱 ：３ ５℃±２℃ 。 ６．２　冰箱：２℃～８℃。 ６．３　均质器。 ６．４　天平：感量０． １ｇ。 ６．５　超净工作台 。 ６．６　微量可调移液器及枪头 ：５ ０μＬ，２ ０ ０μＬ。 ６．７　Ｂ ＡＸ全自动病原菌检测系统 。 ７　检测程序 致病性弧菌全自动病原菌检测系统筛选法的检测程序见图 １。 图１　致病性弧菌全自动病原菌检测系统筛选法的检测程序 ８　操作步骤 ８．１　样品制备 、增菌 ８．１．１　称取检样 ２ ５ｇ，加入装有 ２ ２ ５ｍＬ 碱性蛋白胨水增菌液的广口瓶或均质袋内 。固体样品应用均 质器在８０ ０ ０ｒ／ｍ ｉ ｎ～１ ００ ０ ０ｒ ／ｍ ｉ ｎ条件下均质 ，或用剪刀充分剪碎 。 ８．１．２　３ ５℃±２℃ 培养１ ８ｈ～２ ０ｈ。 ２犛 犖／犜３ １ ９ ６—２ ０ １ ２ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.８．２　细菌犇 犖 犃模板的提取 ８．２．１　打开加热槽 ，分别加热至 ３ ７℃±２℃ 和９ ５℃±３℃ ，检查冷藏过夜的冷却槽 （４℃） 。 ８．２．２　在每个溶菌管中加入 ２ ０ ０μＬ配制好的溶菌试剂 （１ ２ｍＬ裂解缓冲液中加 １ ５ ０μＬ蛋白酶） ，加入 ５μＬ增菌液，盖上盖子 。 ８．２．３　将溶菌管放在 ３ ７℃±２℃ 加热槽中 ，加热２ ０ｍ ｉ ｎ，再将溶菌管转移到 ９ ５℃±３℃ 加热槽中 ，加 热１ ０ｍ ｉ ｎ；最后将溶菌管转移到冷却槽上 ，冷却５ｍ ｉ ｎ。 ８．２．４　剩余增菌肉汤或待鉴定菌株保存于 ２℃～８℃，以备对阳性检测结果进行确认 。 ８．３　上机操作 ８．３．１　开机并启动 Ｂ ＡＸ系统软件 ，如果仪器自检后建议校正 ，按屏幕提示进行校正操作 。 ８．３．２　创建“ｒ ａ ｃ ｋ”文件，根据提示在完整的 “ｒ ａ ｃ ｋ”文件和“个样”资料中输入样品信息 。 ８．３．３　加热循环仪 ／检测仪，从菜单中选择 “ＲＵＮ ＦＵＬ ＬＰ ＲＯＣ Ｅ Ｓ Ｓ ” ，加热到设定温度 （加热槽９ ０℃， 盖子１ ０ ０℃） 。 ８．３．４　将带药片的 Ｐ Ｃ Ｒ八联管放入专用冷却槽内 ，移去管盖 ，将３ ０μＬ细菌ＤＮＡ模板加入八联管 中，盖上八联管盖 。 ８．３．５　在“Ｒ ｅ ａ ｄｙｆ ｏ ｒＲ ａ ｃ ｋＬ ｏ ａ ｄ ”提示框中 ，点击“ＮＥ ＸＴ”按钮。打开仪器托盘 ，将加完样的 Ｐ Ｃ Ｒ八联 管放入托盘中 。关上托盘 ，点击“ＮＥ ＸＴ”按钮，仪器开始自动运行 。 ９　结果报告 ９．１　绿色“－”表示阴性结果 ，红色“＋”表示阳性结果 ，黄色“？”表示不确定结果 ，黄色“？／”表示错误 结果。 ９．２　检测结果阴性 ，根据检测项目 ，可直接报告 ２ ５ｇ（ｍＬ）样品中未检出霍乱弧菌 、副溶血性弧菌和创 伤弧菌。 ９．３　检测结果阳性的样品 ，根据检出的弧菌种类 ，对保存于 ２℃～８℃的增菌液或菌悬液进行确认 。 霍乱弧菌按照 Ｓ Ｎ／Ｔ１ ０ ２ ２或Ｆ ＤＡ／Ｂ ＡＭＣ ｈ ａ ｐｔ ｅ ｒ９或ＮＭＫＬＮ ｏ． １ ５ ６ 方法进行确认 。副溶血性弧菌 按照Ｇ Ｂ／Ｔ４ ７ ８ ９． ７ 或Ｓ Ｎ／Ｔ０ １ ７ ３或Ｆ ＤＡ／Ｂ ＡＭＣ ｈ ａ ｐｔ ｅ ｒ９或ＮＭＫＬＮ ｏ． １ ５ ６ 方法进行确认 。创伤弧 菌按照Ｆ ＤＡ／Ｂ ＡＭＣ ｈ ａ ｐｔ ｅ ｒ９或ＮＭＫＬＮ ｏ． １ ５ ６ 方法进行确认 。 ９．４　检测结果不确定或错误 ，对保存于 ２℃～８℃的增菌液或菌悬液重新提取 ＤＮＡ，上机检测 。 １ ０　防止污染的措施 检测过程中防止交叉污染的措施参照 Ｇ Ｂ／Ｔ２ ７ ４ ０ ３ 。犛 犖／犜３ １ ９ ６—２ ０ １ ２ rHgCb@g · ykbûR60
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SÑU.书书书犛 犖／犜３ １ ９ ６—２ ０ １ ２ 附　录　犃 （资料性附录 ） 培养基和试剂盒 犃．１　碱性蛋白胨水 （犃 犘犠） 犃．１．１　成分 蛋白胨　　　　　　 １ ０． ０ｇ 氯化钠 １ ０． ０ｇ 蒸馏水 １０ ０ ０ｍＬ 犃．１．２　制法 将上述各成分加热搅拌溶解 ，调ｐＨ至（８． ５±０． ２ ） ，分装２ ２ ５ｍＬ 于２ ５ ０ｍＬ 广口瓶中 ，１ ２ １℃高压 灭菌１ ０ｍ ｉ ｎ。 犃．２　犅 犃 犡系统霍乱弧菌 ／副溶血性弧菌 ／创伤弧菌的 犘 犆 犚检测试剂盒组成 犃．２．１　犘 犆 犚片剂 ２袋，每个Ｐ Ｃ Ｒ管中一个片剂 ，１ ２个八联管 。片剂包括检测反应和内置阳性对照反应所需的试剂 （有了内置阳性对照不需另设质控反应 ） 。 犃．２．２　犘 犆 犚管盖 １袋，１ ２个八