ICS 65.120 CCS B 46 团体 标准 宠物添加剂预混合饲料中 6种水溶性维生 素的测定 高效液相色谱法 Determination of 6 water -soluble vitamins in pet feed additive premix — High performance liquid chromatography 2024 -09-23发布 2024 -10-19实施 中国饲料工业协会 发 布 T/CFIAS 6011—2024 全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 T/CFIAS 6011—2024 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中国饲料工业协会团体标准技术委员会提出并归口。 本文件起草单位： 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所、北京市兽药饲料监测中心、浙 江医药股份有限公司昌海生物分公司、中牧农业连锁发展有限公司、上海天祥质量技术服务有限公司、 乖宝宠物食品集团股份有限公司、天津雀巢普瑞纳宠物食品有限公司、深圳红瑞生物科技有限公司、上 海宠幸宠物用品有限公司、皇誉宠物食品（上海）有限公司。 本文件主要起草人： 樊霞、李兰、贾铮、严华、王继彤、姚婷、田静、徐思远、刘晓露、温善萍、 蒋小英、王宁娟、何继红、张驰中、李园、周淼佳、杨文瀚、秦华、徐法典、田甜、胡玉珍、吕少骏、 刘淑琴、陈姝、谢爽、烟利亚、薛德时、娄迎霞、李征、曹林、冯秀燕 。 全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 T/CFIAS 6011—2024 1 宠物添加剂预混合饲料中 6种水溶性维生素的测定 高效液相色谱法 1 范围 本文件描述了宠物添加剂预混合饲料中 6种水溶性维生素含量测定的高效液相色谱法。 本文件适用于标称含有水溶性维生素的宠物添加剂预混合饲料中维生素 B1、维生素 B2、维生素 B6、 烟酸、烟酰胺、叶酸的测定。 本文件中维生素 B1、维生素 B2、维生素 B6、烟酰胺的定量限为 30 mg/kg ；烟酸、叶酸的定量限为 50 mg/kg。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 20195 动物饲料 试样的制备 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 原理 试样中的维生素 B1、维生素 B2、维生素 B6、烟酰胺经酸性溶液提取；烟酸经水提取，固相萃取小柱净 化；叶酸经碱性溶液提取。高效液相色谱仪测定，外标法定量。 5 试剂或材料 除非另有规定，仅使用分析纯试剂。 5.1 水：GB/T 6682 ，一级。 5.2 甲醇：色谱纯。 5.3 庚烷磺酸钠：色谱纯。 5.4 三乙胺：优级纯。 5.5 0.1 mol/L 盐酸溶液：移取 8.5 mL盐酸，用水稀释至 1 000 mL ，混匀。 5.6 1 %冰乙酸溶液：移取 1 mL冰乙酸用水稀释至 100 mL，混匀。 5.7 甲醇/氯化铵溶液（ 1+9）：称取 54 g氯化铵溶解于 500 mL水中，用盐酸调节 pH为3～4，取450 mL该溶液与 50 mL甲醇混合。 5.8 2 mol/L碳酸钠溶液：称取 21.2 g碳酸钠溶解于 100 mL水中，混匀。 5.9 5%甲酸溶液：移取 5 mL甲酸用水稀释至 100 mL，混匀。 全国团体标准信息平台 T/CFIAS 6011—2024 2 5.10 流动相：称取 1.1 g庚烷磺酸钠（ 5.3）、100 mg乙二胺四乙酸二钠（ EDTA二钠盐）于 1 000 mL 烧杯中，加入约 950 mL水，加入 5 mL三乙胺（ 5.4），用约 25 mL冰乙酸调节溶液 pH为3.70。加水 定容至1 000 mL容量瓶中，混匀，微孔滤膜（ 5.20）过滤。取该溶液 800 mL与200 mL甲醇（5.2）混 合，脱气，备用。 警示：5.11~5.19 条款操作应避免强光照射 5.11 维生素B1标准储备溶液（以硝酸硫胺计， 1 mg/mL）：称取 50 mg硝酸硫胺标准品（ CAS号：532- 43-4，纯度≥ 97%) (精确至0.1 mg）于50 mL棕色容量瓶中，加入盐酸溶液（ 5.5）超声溶解并定容。 2 ℃～8 ℃保存，有效期 6个月。 注：也可以使用盐酸硫胺标准品（ CAS号：67-03-8，纯度≥ 97%）,结果以盐酸硫胺表达。 5.12 维生素B2标准储备溶液（以核黄素计， 100 µg/mL）：称取 25 mg核黄素标准品（ CAS号：83-88- 5，纯度≥97%)（精确至 0.1 mg）于250 mL棕色锥形瓶中，加入 2.5 mL冰乙酸、约 200 mL水， 于100 ℃ 水浴中加热至完全溶解，冷却后转移至 250 mL棕色容量瓶中，用水定容。 2 ℃～8 ℃保存，有效期 6 个月。 5.13 维生素B6标准储备溶液（以盐酸吡哆醇计， 1 mg/mL）：称取 50 mg盐酸吡哆醇标准品（ CAS号： 58-56-0，纯度≥ 97%) (精确至0.1 mg）于50 mL棕色容量瓶中，加入盐酸溶液（ 5.5）超声溶解并定 容。2 ℃～8 ℃保存，有效期 6个月。 5.14 烟酸标准储备溶液（ 1 mg/mL）：称取 50 mg烟酸标准品（ CAS号：59-56-0，纯度≥ 99%) (精确 至0.1 mg）于50 mL棕色容量瓶中，用水溶解、定容。 2 ℃～8 ℃保存，有效期 6个月。 5.15 烟酰胺标准储备溶液（ 1 mg/mL）：称取 50 mg烟酰胺标准品（ CAS号：98-92-0，纯度≥ 99%) (精 确至0.000 1 g ）于50 mL棕色容量瓶中，用水溶解、定容。 2 ℃～8 ℃保存，有效期 6个月。 5.16 叶酸标准储备溶液（ 0.5 mg/mL ）：称取 25 mg叶酸标准品（ CAS号：59-30-3，纯度≥ 95%) (精 确至0.1 mg）于50 mL棕色容量瓶中，加入碳酸钠溶液（ 5.8）2 mL、约45 mL水，超声溶解，用水定 容。2 ℃～8 ℃保存，有效期 6个月。 5.17 5种维生素混合标准系列溶液：分别准确移取维生素标准储备溶液（ 5.11-5.15）适量，用水稀释 并定容，配制成维生素 B1、维生素 B2、维生素 B6、烟酸和烟酰胺浓度分别为 1 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL的混合标准系列溶液。临用现配。 5.18 叶酸标准系列溶液：准确移取叶酸标准储备溶液（ 5.16）适量，用水稀释并定容，配制成浓度为 1 μg/mL、2 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL的标准系列溶液。临用现配。 5.19 阳离子交换固相萃取小柱： 200 mg/6 mL ，或性能相当者。 5.20 微孔滤膜： 0.45 μm，水系。 6 仪器设备 6.1 高效液相色谱仪：配紫外检测器（或二极管阵列检测器）。 6.2 分析天平：精度为 0.1 mg。 6.3 恒温水浴锅：控温精度为± 1 ℃。 6.4 超声波清洗仪。 6.5 离心机：转速不低于 7000 r/min 。 6.6 酸度计：精度为± 0.01。 7 样品 按GB/T 20195 制备试样。固体试样至少 200 g，粉碎使其全部通过 0.425 mm 孔径的分析筛，充分混 匀，密闭容器中避光保存，备用。膏状或液体原包装保存，备用。 全国团体标准信息平台 T/CFIAS 6011—2024 3 8 试验步骤 警示：以下操作应避免强光照射。 8.1 维生素B1、维生素 B2、维生素 B6、烟酰胺的提取 平行做两份试验。称取试样适量（称样量按附录 A执行），精确至 0.1 mg，置于100 mL棕色锥形瓶 中，加入约 70 mL冰乙酸溶液（ 5.6），充分混匀，置于 100 ℃水浴中加热 30 min（中间旋摇两次，避免 样品附着于瓶底），冷却至室温后转移至 100 mL棕色容量瓶中，用水定容。移取约 5 mL该溶液，于 7 000 r/min离心10 min，取上清液微孔滤膜（ 5.20）过滤，待测。 8.2 含吸附剂的粉状试样中维生素 B1的提取 平行做两份试验。称取试样适量（称样量按附录 A执行），精确至 0.1 mg，置于100 mL棕色容量瓶 中，加入约 70 mL甲醇/氯化铵溶液（ 5.7），超声提取 30 min（中间旋摇两次，避免样品附着于瓶底）， 冷却至室温后，用甲醇 /氯化铵溶液（ 5.7）定容。移取约 5 mL该溶液，于 7 000 r/min 离心10 min，取 上清液微孔滤膜（ 5.20）过滤，待测