ICS 07.100.30 CCS C 53 团 体 标 准 T/CIQA 12 4—2025 饮料和包装饮用水 中霉菌和酵母快速 计数 荧光染色方法 Rapid detection of mold s and yeast s in beverages and drinking water —— Fluorescent staining method 2025 -07-14 发布 2025 -07-14实施 中国出入境检验检疫协会 发布 全国团体标准信息平台 T/CIQA 12 4—2025 Ⅱ 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 -2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中国出入境检验检疫协会进出口食品标准化技术委员会（ CIQA/TC10) 提出并归口。 本文件起草单位：默克化工技术（上海）有限公司 、可口可乐饮料（上海）有限公司 -亚太技术中 心、中农孚德检测技术（北京）有限公司 、通标标准技术服务（青岛）有限公司 、上海康识食品科技公 司、 河北省产品质量安全检测技术中心、青岛啤酒优家健康饮品 （上海） 有限公司、 今麦郎饮品 （天长） 有限公司 、乐源健康科技（湖州）有限公司 。 本文件主要起草人：陈洁、付敏、王亦宁、晨凡、李梦兰、王琦、周婀、单萌、 李雁鹏、王玉 花、李蹊桃、丁燕、罗峰、 聂飞霞、沈晓骅。 本文件知识产权归中国出入境检验检疫协会所有。任何单位或个人未经许可，不得以营利为目的， 印制、出版、翻译、转发或复制全文或部分文字。 全国团体标准信息平台 T/CIQA 12 4—2025 饮料和包装饮用水 中霉菌和酵母快速计数 ——荧光染色方法 1 范围 本文件描述了饮料和包装饮用水中霉菌和 酵母荧光染色快速计数方法。 本文件适用于饮料、包装饮用水以及经稀释可过滤的 饮料浓缩汁 （葡萄浓缩汁、苹果浓缩汁 等）、固体饮料中霉菌和 酵母的快速测定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中 ,注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件 :不注日期的引用文件，其最新版本 (包括所有的修改单 )适用于本文 件。 GB 4789.1 食品安全国家标准 食品微生物学检验 总则 GB 4789.15 食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数 GB 4789.25 食品安全国家标准 食品微生物学检验酒类、饮料、冷冻饮品采样和检样处理 GB 4789.45 食品安全国家标准 微生物检验方法验证通则 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 3 术语和定义 GB 4789.15 和GB 4789.25 中界定的术语和定义适用于本文件 4 方法原理 本方法基于荧光染色技术 和膜过滤技术 ，对滤膜上收集的 具生物活性的霉菌和 酵母进行荧光染色 并计数。 霉菌和酵母代谢过程产生的酶可分解荧光染色剂，释放荧光素 ，荧光素在 活细胞内积累并发出 荧光，该荧光被 EZ-Fluo™/Milliflex® Quantum1)微生物快速检测系统捕获并放大， 从而实现对 霉菌和酵 母的快速计数 。 全国团体标准信息平台 T/CIQA 12 4—2025 2 5 设备和材料 5.1恒温培养箱： 28 ℃±1 ℃ ，32.5 ℃± 2.5 ℃。 5.2无菌移液管 或移液器及 相应吸头： 1 mL(具0.01 mL刻度 )、10 mL(具0.1 mL刻度 )。 5.3无菌锥形瓶：容量 500 mL。 5.4 EZ-Fluo™/Milliflex ® Quantum微生物快 速检测系统 。 5.5 EZ-Fit1）过滤系统 或者 Oasis1）一体化过滤系统（含泵，泵真空压力小于 75 KPa）。 5.6 Petri-PadTM1）无菌平皿。 5.7 S-Pak®1）或者 EZ-Pak®1）无菌滤膜 :孔径 0.45 μm，直径 47 mm，材质 MCE（混合纤维素）。 5.8 EZ-Fit™1）一次性滤杯（含滤膜）， Microfil1） 滤杯（不含滤膜）。 5.9 无菌平头镊子。 5.10 电子天平：感量 0.1g。 6 培养基和试剂 6.1 马铃薯葡萄糖琼脂 ：见 A.1，也可以使用商品化的马铃薯葡萄糖琼脂培养基。 6.2 磷酸盐缓冲液 ：见 A.2。 6.3 生理盐水 ：见 A.3。 6.4 蒸馏水。 6.5 EZ-Fluo™/Milliflex ® Quantum荧光染色试剂 。 1)EZ -Fluo™/Milliflex ® Quantum、EZ-Fit、Oasis、Petri -PadTM、S-Pak、EZ-Pak®、EZ-Fit™、Microfil 是由默克化工技术（上海）有限公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本文件使用者。如 果其他产品具有相同的效果 ,那么可使用这些等效的产品。 全国团体标准信息平台 T/CIQA 12 4—2025 3 7 检测程序 图1 霉菌和酵母荧光染色法检验程序 8.操作步骤 8.1 样品前处理 8.1.1包装饮用水、不含固形物的饮料可直接滤膜过滤。 建议取样量不少于 10 mL。 8.1.2饮料浓缩汁和固体饮料样品，取 25mL（g）样品置于 225 mL无菌磷酸盐缓冲液或无菌生理盐水 或无 菌蒸馏水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min～2 min，制成 1:10的样品匀液。根据样品污染程 度的估计选择 2～3个适宜稀释度的样品匀液滤膜过滤 ，液体样品可包括原液 。 8.1.3对于含有固形物的饮料，采用带滤网的均质袋进行初过滤，制成 1:10的样品匀液，根据样品污染程 度的估计选择 2～3个适宜稀释度的样品匀液进行滤膜过滤。 8.2 样品过滤 全国团体标准信息平台 T/CIQA 12 4—2025 4 参照 GB 4789.25 的要求，将 滤杯安装在过滤系统上， 按需安装滤膜， 取适量 （不少于 10 mL）的样 品进行抽滤，再用 15 mL无菌稀释液冲洗滤杯并抽滤。必要时可用无菌磷酸盐缓冲液或无菌生理盐水 或 无菌蒸馏水冲洗滤杯内壁 1 ～3 次，以确保将沾附在滤杯壁上的检样完全冲洗到滤膜上。抽滤完成后 取下滤杯。 8.3 滤膜转移和培养 8.3.1用无菌平头镊子取出滤膜并无菌转移到马铃薯葡萄糖琼脂 培养皿上，均匀平铺于培养基上，应避免 产生褶皱和气泡。 8.3.2置于 28 ℃± 1 ℃，倒置培养 24 h～48 h。培养 24 h将培养皿取出， 如肉眼观察到可见的微小菌落， 即可进行荧光染色；如 24 h未见微小菌落， 则将培养皿放回培养箱， 继续培养 至48 h再进行荧光染色 。 8.4 荧光染色 8.4.1 荧光染色试剂准备 将荧光染色试剂的温度平衡至室温。使用前充分摇匀染色溶液，每次使用时荧光染色试剂室温下放置不 得超过 4 h。 8.4.2 荧光染色 8.4.2.1 取一个 Petri-PadTM染色皿，用无菌移液管或移液器吸取 1.7 ～2 mL荧光染色试剂加入 Petri-PadTM 染色皿垫片上，直至整个垫片被浸湿。 8.4.2.2 从培养箱中取出培养皿，用无菌 平头镊子将滤膜 无菌转移到染 色皿垫片上， 避免产生褶皱和气 泡，盖上皿盖。 8.4.2.3 将染色后的染色皿 置于 32.5 ℃± 2.5 ℃，倒置培养 30 min。 8.5 计数 将EZ-Fluo™/Milliflex ® Quantum微生物快速检测系统开机。 从培养箱中取出 8.4.2.3 的Petri -PadTM染 色皿， 无需打开皿盖， 直接将 Petri -PadTM染色皿放入 EZ-Fluo™/Milliflex ® Quantum微生物快速检测系统读 数器拉板中，通过 EZ-Fluo™/Milliflex ® Quantum微生物快速检测系统上的读数器窗口，进行计数，每一 个发光点记为一个菌落， 可用 计数按钮 进行计数 ， 读数器屏幕 可显示数值 ， 也可使用 EZ-Fluo™/Milliflex® Quantum 计数软件进行计数。 8.6 继续培养 计数完成后，可使用无菌镊子将 染色滤膜转移到新鲜的马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，按照 GB 4789.15第一法的要求继续培养到 5 d观察结果，以便于对霉菌和 酵母进行鉴定。 全国团体标准信息平台 T/CIQA 12 4—2025 5 9 结果与报告 结果的计算方法和报告规则按照 GB 4789.15 ； 报告单位为： CFU/实际检样量 mL(g)。 10 废弃物处理 检验后样品和废弃物按照 GB 4789.1 的相关要求进行处置。