SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T1086-2011 代替SN/T1086—2002 牛生殖道弯曲杆菌病检疫技术规范 Quarantineprotocol for bovine genital campylobacteriosis 2011-05-31发布 2011-12-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1086--2011 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。 本标准代替SN/T1086一2002《胎儿弯杆菌的分离鉴定方法》。 本标准与SN/T1086一2002相比，主要技术变化如下： 修改了标准名称； -增加了间接荧光抗体检测方法和PCR检测方法。 本标准参考了世界动物卫生组织（OIE)《陆生动物诊断试验和疫苗手册（哺乳动物、禽鸟与蜜蜂）》 (2009版)(ManualofDiagnosticTestsandVaccinesforTerrestrialAnimals2009)第2.4.5章内容。 主要修改如下： -本标准采用了OIE规定的病原分离鉴定方法、间接荧光抗体检测方法、PCR检测方法； 本标准删除了OIE中提到ELISA方法。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：侯艳梅、郭福生、秦贞奎、霍蕾、栾慎顺。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： -SN/T1086—2002。 SN/T1086—2011 牛生殖道弯曲杆菌病检疫技术规范 1 范围 本标准规定了牛生殖道弯曲杆菌病的检疫技术要求。 本标准适用于牛生殖道弯曲杆菌病病原的分离鉴定，可用于该病的检疫、诊断和流行病学调查。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682 2分析实验室用水规格和试验方法 3缩略语 TEM：增菌运输培养基 CH：半胱氨酸牛心浸膏培养基 MH：MullerHinton琼脂培养基 4设备和材料 4.1混合气休（质量比为3.5%O2、10%CO2，86.5%N.）。 4.2厌氧培养罐。 4.3买 采样棒及吸球。 4.4 凝胶成像系统。 5 培养基和试剂 见附录A。实验用水应符合GB/T6682的要求。 6病原分离与鉴定 6.1样品采集 6.1.1公牛包皮垢及精液 消毒清洗公牛尿道口后，将采样棒的采样端插入阴筒内，将另一端的吸球压扁并来回抽动，吸取包 皮液，取出采样棒迅速插入盛有3mLPBS液的小瓶中吹吸数次后，立即封口。 包皮冲洗时，用20mL30mLPBS液注人包皮囊内，用力摩擦15s～20s后，将注人液体收集到 无菌瓶内，立即封口；包皮垢亦可在采精后从假阴道中收集，即用20mL～30mLPBS液冲洗假阴道 获得。 1 SN/T1086-2011 弯曲杆菌在MH或CH琼脂平板培养基上的菌落特征为：不溶血、半透明、光滑、周边整齐、圆整、直径 为1mm3mm左右。 6.5胎儿弯曲杆菌的鉴定 6.5.1筛选试验 6.5.1.1取典型或可疑菌落纯培养物做革兰氏染色、运动力观察、氧化酶试验及触酶试验。 胎儿弯曲杆菌为革兰氏阴性杆菌，呈螺旋转或“S”状，一些老龄培养物可出现球状或球杆状，不形 成芽孢和荚膜，在菌体的一端或两端有鞭毛，呈特征性快速螺旋状穿梭运动。 6.5.1.2纯培养平板用后应尽快放回混合气体环境，备进一步做生化试验和荧光抗体试验用。 6.5.2生化试验 6.5.2.1取典型或可疑菌落纯培养物按表1进行生化试验。 所有生化试验管均置于混合气体环境中，37%培养3d。胶盖的螺旋管，培养时应将试管盖 放松。 胎儿弯曲杆菌生化反应 表 生长实验 药敏实验 硫化氢 马尿酸 过氧化氢 氧化酶 3.5% 钠水解 菌名 (H,S) 1% 素啶酮酸 头孢霉素 试验 酶实验 1%计 氯化钠 25℃ 实验 实验 甘氨酸 30 μg/片 30 μg/片 (Nacl) 胎儿弯曲 R S 杆菌胎儿 亚种 胎儿弯曲 R 杆菌性病 S 亚种 注：“+" 阴性发应， 反应不定 -指抗；"s"- 一敏感。 阳性反应；“一” 6.5.2.2生长试验：取典型或可凝菌落纯培养物接种到2管疏基乙酸肉汤中，分别置于43℃和25℃ 温箱培养72h观察结果。如果肉汤工层出现雾状浑浊，说翻细凿包生长。 6.5.2.3硫化氢（HS)试验：取典型或可疑菌落纯培养物接种于巯基乙酸肉汤中，试管口悬吊一条 长×宽为20mm×6mm的乙酸铅滤纸，观察3d~4d，如见滤纸变黑即为产生HzS。 6.5.2.4甘氨酸、氯化钠、胆汁生长试验：取典型或可疑菌落纯培养物分别接种于含1%甘氨酸、3.5% 氯化钠、1%胆汁的巯基乙酸肉汤中，37℃培养72h，如果肉汤上层出现雾状浑浊，说明细菌已生长。 6.5.2.5药物敏感试验：用铂金耳挑取典型或可疑菌落的纯培养物，置于1mL灭菌生理盐水试管中， 制成浓度约为10°个/mL的菌液，将菌液涂布于MH琼脂平板上，然后用镊子把含有30μg萘啶酮酸 和头孢霉素的滤纸片贴在MH血平板上，于混合气体37℃培养48h～72h，在药敏纸片周围产生3mm 以上抑菌区为敏感。 6.5.2.6马尿酸钠水解试验：取典型或可疑菌落纯培养物接种于0.4mL1%马尿酸钠液中制成菌悬 液，35℃～37℃水浴2h，加人0.2mL三酮试剂，混匀后水浴20min观察结果。变深紫色为阳性，淡 紫色或不变色为阴性。同时可用18h～24h变形杆菌培养物作为阳性对照。 3 SN/T1086—2011 6.5.3结果判定 凡符合胎儿弯曲杆菌一般特征和生化特征的菌，均判定为胎儿弯曲杆菌阳性 过氧化氢酶试验、H.S试验、1%胆汁生长试验、3.5%氯化钠生长试验和马尿酸水解试验.其中任 何一项不符合胎儿弯曲杆菌特性的，则判定为胎儿弯曲杆菌阴性。 7间接免疫荧光试验 7.1制备免疫血清 将标准的胎儿弯曲杆菌菌株（胎儿弯曲杆菌性病亚种或胎儿弯曲杆菌胎儿亚种)接种到MH或CH 琼脂平板培养基（含10%绵羊血)上，37℃混合气体培养3d，将菌体收获到PBS液中，离心洗涤两次。 将胎儿弯曲杆菌悬浮于PBS液中，制成浓度为1011个/mL的菌悬液，加人弗氏不完全佐剂后，肌肉注射 3月龄免子，每只2mL，分4个注射点，每个注射点接种0.5ml。接种前及接种后每隔一周采血一次. 当血清滴度达到105或以上时（用胎儿弯曲杆菌血清凝集试验或免疫荧光试验）.再静脉注射0.1mL~ 1.0mL浓度为101°个/mL的菌悬液，7d后采血，将不同免子的血清混合在一起，作为免疫血清。 7.2确定工作稀释度 用标准胎儿弯曲杆菌培养物涂片检测PBS稀释的不同浓度的免疫血清，确定工作稀释度。与待检 菌产生明显荧光的最低浓度的2倍，即为工作稀释度。 7.3酶标记抗体 选用商品羊抗免辣根过氧化物酶标记抗体，按说明书给出的工作浓度使用。 7.4样品制备 生殖道液体样品（包括胎儿胃内容物、包皮垢冲洗液和阴道粘液）加入5mL1%福尔马林PBS液， 2次离心。先在4℃600g离心10min，取上清液，再在4℃8000g离心30min，保留100μL上清液，将 沉积物溶其中，作为被检样品。 7.5间接免疫荧光试验 取20μL7.4制备的样品涂布在玻片上。用丙酮经一20℃30min固定，或者用乙醇经18℃～25℃ 30min固定，风干玻片后，加人工作浓度的免疫血清，在湿盒中37℃感作30min，用PBS液冲洗玻片 3次.再加人羊抗免辣根过氧化物酶标记抗体，湿盒中37℃避光感作30min。用PBS液冲洗玻片3次. 每次10min。最后用甘油缓冲剂（90%甘油：10%PBS)封固玻片。盖上盖玻片以防干燥，用荧光显微镜 观察。同时用胎儿弯曲杆菌属作为阳性对照，其他弯曲杆菌属作为阴性对照。 7.6结果判断 产生荧光并且有胎儿弯曲杆菌属典型菌体形态的，判定为胎儿弯曲杆菌阳性（见附录C)。 本荧光试验可以用来鉴定从样品中分离出的胎儿弯曲杆菌菌株，但不能用于菌株亚种的鉴别。 8PCR法 8.1病料处理 按照7.4方法制备被检样品。 4 SN/T1086—2011 8.2DNA提取 使用DNA快速抽提纯化试剂盒抽提基因组DNA。 8.3PCR试验 8.3.1引物 用于鉴定牛胎儿弯曲杆菌胎儿亚种的引物对： qh3F 5'-GGTAGCCGCAGCTGCTAAGAT-3* qh4R 5'-TAGCATCAATAACGACAACT-3" 用于鉴定牛胎儿弯曲杆菌性病亚种的引物对： qhVenSF 5'-CTTAGCAGTTTGCGATATTGCCATT-3' qhVenSR 5'-GCTTTTGAGATAACAATAAGAGCTT-3' 8.3.2PCR反应体系 应用50μL反应体系进行反应。在PCR管中，依次加人以下试剂： 模板DNA 2 μL 上游引物（25pmol/L） 2 μL 下游引物（25pmol/L） 2 ul. dNTP(2.5mmol/L) 4 μL TaqDNA聚合酶（2.5U/μL）1μL 10×PCR缓冲液 5 μL O"HPP 34 μL 8.3.3PCR反应条件 8.3.3.1鉴定牛胎儿弯曲杆菌胎儿亚种： 95℃预变性5min；95℃/30s，58℃/30s，72℃/60s，运行35个循环；72℃/10min；4℃，保存。 8.3.3.2鉴定牛胎儿弯曲杆菌性病亚种： 95℃预变性5min；95℃/30s，58℃/30s，72℃/30s，运行35个循环；72℃/10min4℃，保存。 8.4PC