SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T11822010 代替SN/T1182.1—2003,SN/T1182.2—2004 禽流感检疫技术规范 Quarantine protocol for avian influenza 2011-05-01实施 2010-11-01发布 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 中华人民共和国出入境检验检疫 行业标准 禽流感检疫技术规范 SN/T1182—2010 中国标准出版社出版 北京复兴门外三里河北街16号 邮政编码：100045 网址www.spc.net.cn 电话：6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 * 开本880×12301/16 印张1.75字数49千字 2011年7月第一版 2011年7月第一次印刷 印数11600 * 书号：155066·2-22192 SN/T1182—2010 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准参考了OIE《陆生动物诊断试验和疫苗标准手册》（2008版）2.3.4章以及WHO《WHO动 物流感诊断和监测手册》（WHO/CDS/CSR/NCS/2002.5Rev.1）。 本标准代替SN/T1182.1—2003《禽流感抗体检测方法：琼脂免疫扩散试验》和SN/T1182.2— 2004《禽流感微量红细胞凝集抑制试验》。本标准与SN/T1182.12003、SN/T1182.2—2004相比， 主要技术变化如下： 一增加了临床诊断方法； 一增加了病原分离鉴定方法； 增加了禽流感病毒核酸检测方法。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国北京出人境检验检疫局、中华人民共和国珠海出人境检验检 疫局。 本标准主要起草人：高志强、乔彩霞、徐海聂、张鹤晓、薄清如、谷强、廖秀云、蒲静、罗宝正、汪琳、 张伟、柏亚铎、薛景山、潘文波、周思波、王小玉。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： SN/T1182.1—2003; SN/T1182.2—2004。 SN/T11822010 禽流感检疫技术规范 1范围 本标准规定了进出口禽类及其产品禽流感检疫的技术规范。 本标准适用于禽流感的检验检疫。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T19438.1禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法 GB/T19438.2H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法 GB/T19438.3H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法 GB/T19438.4H9亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法 GB19489实验室生物安全通用要求 3符号和缩略语 下列缩略语适用于本文件。 AGID: 琼脂凝胶免疫扩散试验 AI: 禽流感 AIV: 禽流感病毒 cDNA: 互补DNA DNA: 脱氧核糖核酸 DEPC: 焦碳酸乙二酯 HPAI: 高致病性禽流感 HPAIV: 高致病性禽流感病毒 HPNAI: 需通报的高致病性禽流感 HA: 血凝试验 HI: 血凝抑制试验 HAU: 血凝单位 IVPI: 静脉接种致病指数 LPAIV: 低致病性禽流感病毒 LPNAI: 需通报的低致病性禽流感 M-MLV反转录酶： 莫洛尼鼠白血病病毒反转录酶 NA: 神经氨酸酶试验 NAI: 神经氨酸酶抑制试验 NAU: 神经氨酸酶活性单位 PBS: 磷酸盐缓冲盐水 SN/T1182—2010 RT-PCR: 反转录一聚合酶链反应 RNA: 核糖核酸 SPF: 无特定病原体 Taq酶： TaqDNA聚合酶 2.5mmol/LeachdNTP：4种脱氧核糖核苷酸的混合物，每种脱氧核糖核苷酸的浓度均为2.5mmol/L 4临床诊断 4.1流行病学 AIV的宿主广泛，各种家禽及野鸟、水禽、海鸟等均可感染。其中以鸡和火鸡感染禽流感病毒后的 危害最为严重。各种日龄的禽均可感染。AIV主要通过患禽间（包括与患禽接触的器皿）的直接接触 和间接接触传染。此外，带毒的飞鸟或水禽常常成为传染源。根据AIV的致病性不同，可分为 HPAIV,LPAIV和无致病性AIV。任何HPAIV分离株都属于HPNAI病毒。对于H5或H7亚型病 毒，如果其血凝素切割位点的氨基酸序列同任何一株强毒力病毒的相应序列相似，即为HPNAI病毒 株；如果其血凝素切割位点的氮基酸序列同任何HPNAI毒株的相应序列都不同，则为LPNAI病毒。 对于非H5或非H7的禽流感病毒株，如果不具有高致病性，则认为是LPAIV。 4.2临床症状 AI的潜伏期从几小时到3d不等。 HPAI常可引起家禽大批发病死亡，常常突然爆发，无任何临床症状而死亡。病程稍长可见精神萎 顿、不食、衰弱、羽毛松乱，头翅下垂，饮欲增加。可出现水样腹泻。鸡冠和肉髯呈暗紫色，头部水肿，有 时可波及到颈部，脚鳞出血等症状。结膜肿胀发炎，有时可见出血。有些病例出现神经症状，抽搐，运动 失调，瘫痪和半瘫痪，失明。鼻腔内有粘性分泌物，病鸡常摇头，呼吸困难，呼吸症状的严重程度取决于 气管的病变程度。对于蛋鸡，通常开始时仅有部分笼舍的鸡发病，然后逐渐传播到邻近的笼舍。出现症 状后可在24h内发生死亡，死亡高峰在48h内，但有时病程可达1周，一些病重的母鸡有时可发生康 复。对于肉鸡，精神沉郁，食欲不振等症状相对不明显，开始常仅表现为死亡率增加，也可出现头颈水肿 和神经症状。火鸡的症状同蛋鸡相似，病程为2d～3d或更长，偶尔可见窦部水肿。对于家养鸭和鹅， 表现为精神沉郁，厌食，腹泻等类似蛋鸡的症状，此外可见窦部水肿；幼鸭和幼鹅常表现神经症状。 4.3病理变化 4.3.1眼观病变 对于最急性病例，除严重的肌肉充血和脱水外，看不到其他病变。但对于一般的急性病例，通常可 看到明显的肉眼病变。头颈部皮下水肿明显。死亡鸡的眼观病变主要表现为大量充血、出血、渗出液或 漏出液和坏死变化。在前驱期症状变化主要是由于眶下窦的肿胀而导致的头面部肿大，冠、肉垂出血， 发结，水肿。在腿部还可看到充血、出血等。随着病程进展，内脏变化较大，表现为各器官的出血、变性 和坏死。内脏器官浆膜面和粘膜面斑块出血，特别是腺胃、肌胃连接处附近的腺胃粘膜面出血严重。气 管粘膜充血，出血，积有干酪样分泌物，心外膜及冠状沟出血，血管受损，水肿，有出血点，有时可见胰腺 出血或有淡黄色坏死点。 4.3.2组织学病变 组织学病变主要见于心脏、脾脏、肾脏、脑、肉弊及卵巢等脏器和组织，主要特征为水肿、充血、出血 和血管周围的淋巴细胞管套形成为特征。在心、脾、肾等内脏气管和组织中，可见到嗜酸性细胞和异嗜 2 SN/T1182—2010 性细胞的浸润及坏死灶的形成。脑的病变为充血，坏死，淋巴细胞管套形成，神经胶质细胞浸润和血管 增生等一系列非化脓性脑炎的病理变化。 5实验室诊断 5.1病原分离监定 5.1.1实验室生物安全要求 AIV病原分离鉴定以及致病性测定应在具有生物安全3级条件的实验室中进行，实验室条件符合 GB19489要求。 5.1.2 设备、材料和试剂 5.1.2.1设备 高速台式冷冻离心机（离心速度12000r/min以上）； 台式离心机（离心速度3000r/min）； 旋涡振荡器； 冰箱（2℃~~8℃和-20℃两种）； 微量可调移液器（10μL、100μL、1000μL）。 5.1.2.2材料和试剂 采样用： 棉拭子、剪刀、镊子、注射器、1.5mL离心管、研钵。采样工具应经121℃土2℃，15min高压 灭菌并烘干； -pH7.2,0.01mol/LPBS，配制方法见附录A； 抗生素：青霉素、链霉素。 鸡胚接种用： 照蛋器、打孔器、酒精灯； pH7.2，0.01mol/LPBS，配制方法见附录A； 5%碘； -70%酒精； -1.0mL次性灭菌注射器； 石蜡； -9日龄～11日龄SPF鸡胚。 AGID鉴定用： 一酒精灯； 一琼脂板，制备方法见附录B； 标准抗原，标准阴性和阳性血清。 HA以及HI鉴定用： -96孔V型微量反应板，振荡器，25μL微量加样器； 一阿氏（Alsevers）液、鸡红细胞悬液，配制方法见附录C； pH7.2,0.01mol/LPBS，配制方法见附录A； 标准离流感病毒血凝素分型抗原，分型阳性血清和阴性血清。 NA及NAI鉴定用： SN/T1182—2010 0.4mol/L、pH5.9的磷酸缓冲液，配制方法见D.1； -胎球蛋白溶液，配制方法见D.2； 过碘酸盐试剂，配制方法见D.3； 亚砷酸盐试剂，配制方法见D.4； 硫代巴比妥酸试剂，配制方法见D.5； 酸化正丁醇试剂，配制方法见D.6； -0.01mol/L、pH7.3PBS，配制方法见D.7。 病毒株致病性测定用： 6周龄SPF鸡，10只； 一新鲜无菌的鸡胚感染尿囊液且血凝价大于1/16； 无RNA酶的带滤芯吸头； 无RNA酶的离心管（1.5L）； 病毒RNA提取试剂TRIZOL; RT-PCR酶颗粒（如AmershamReady-to-GoRT-PCRBeads或其他等效试剂）； DEPC处理的灭菌双蒸水，配制方法见E.1； 50×TAE缓冲液，配制方法见E.2； 0.8%琼脂糖凝胶，配制方法免E.3； -10×电泳上样缓冲液，配制方法见E.4； DNA分子量标准。 5.1.3采样、送检和处理 5.1.3.1活禽样品 咽喉拭子采样：采样时要将拭子深人喉头及上鳄裂来回刮3次～5次，取咽喉分泌液。 泄殖腔拭子采样：将拭子深入泄殖腔转圈沾取粪便。 将采样后的咽喉拭