SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 1224-2012 代替SN/T1224—2003 禽支原体病检疫技术规范 Quarantine protocol for avain mycoplasmosis 2012-12-12发布 2013-07-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T1224—2012 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准与OIE《ManualofDiagnosticTestsandVaccinesforTerrestrialAnimals》（2o10版） 第2.3.5节《禽支原体病诊断标准》的一致性为非等效。 本标准代替SN/T1224-2003《鸡败血支原体感染抗体检测方法快速血清凝集试验》。 本标准与SN/T1224一2003相比，主要技术变化如下： 一增补了该病的临床病理诊断内容； 在实验室诊断方法上增加了病原分离及间接免疫荧光（IFA）、PCR鉴定方法，免疫胶体金快速 检测、血凝抑制试验和酶联免疫吸附试验方法。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国湖北出入境检验检疫局、华中农业大学、中华人民共和国深圳出 人境检验检疫局。 本标准主要起草人：陈建军、肖运才、李东、冯汉利、叶奕优、曾宪东、杨武、毕丁仁、郭明星。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： -SN/T1224—2003。 I. SN/T1224—2012 禽离支原体病检疫技术规范 1范围 本标准规定了禽支原体病的临床诊断、血清学诊断及禽败血支原体（MG)分离培养和鉴定方法。 本标准适用于禽支原体病的检疫诊断。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 AM：禽支原体病（avainmycoplasmosis） CRD：慢性呼吸道疾病（chronicrespiratorydisease） MG：禽败血支原体（禽败血霉形体）（mycoplasmagallisepticum） MS：滑液支原体（mycoplasmasynoviae） 4 疫病概述 禽感染各类致病性支原体引起的疾病都统称为禽支原体病（AM），其中由MG感染所致的AM最 为常见，又称鸡慢性呼吸道病（CRD)，其病原学、流行病学、临床症状及病理变化参见附录A。 5 实验室诊断 5.1MG的分离培养 5.1.1材料准备 5.1.1.1检验设备、器材：生物显微镜、入射式荧光显微镜、二氧化碳培养箱、灭菌棉拭子、载玻片、pH 精密试纸。 5.1.2病料的采取和保存 病料从活禽及新鲜的死禽中采集，对于活禽，可从鼻腔、口咽部、眼部、食管、气管、泄殖腔和交合器 中取样。死禽从鼻腔、眶下窦、气管或气囊采样，也可吸取眶下窦和关节渗出物或结膜囊内冲洗物。鸡 胚从卵黄囊内表面、口咽和气囊采样。小块组织置于MG液体培养基中，拭子在培养基中用力搅拌数 次，样品尽快培养。所有实验操作应符合中GB19489实验室生物安全通用要求的规定。 1 SN/T12242012 5.1.3分离培养 同时将样品接种于MG固体培养基中，置于含5%～10%二氧化碳培养箱中培养。 5.1.3.2每天检查液体培养基酸碱度，-旦发现pH值变化，立即接种于MG固体培养基中培养。若 培养基酸碱度没有变化，每隔3d～5d盲传一代，共传3代，培养10d后接种于MG固体培养基上 培养。 5.1.3.3MG固体培养基上若有菌落生长，用低倍显微镜观察，可见中央突起呈荷包蛋样典型菌落（参 见附录C.1)，可初步判断为MG，菌落形态不典型时，需进一步作血清学、分子生物学鉴定。 5.1.4纯化 将液体培养物稀释至10-4 体培养基，待典型菌落长成时，挑取单个菌落接 种MG液体培养基，重复三次培弹竞隆 5.1.5生化特征 MG和MS可发酵葡萄糖，但不熊 5.2病原鉴定 5.2.1间接免疫荧光抗体试验 5.2.1.1取1.0cm～1.5cm的琼脂块，菌落面朝上置于载玻片上，第一块载玻片上放一块待检分离 块已知其他原体菌落，第二块载玻片上放一块待检分离物。 物、一块已知MG菌落（S6或R株）、 滴器 加一滴正常兔血清。 5.2.1.3琼脂块在湿盒中室 分别放到含有pH7.2PBS磷酸盐缓冲液的不间 器皿中，冲洗10min，冲洗2 5.2.1.4将琼脂块放回原玻 水纸吸 物，反应、洗涤同5.2.1.3，最 吸干多余 于入射式荧光显微镜下检查结果。 5.2.1.5结果判定：菌落呈现 生反应， 若仪有瞻淡的菌落轮廓，与背景荧光颜色差别 不大为阴性。当其他已知支原 截玻片分离物为阴性反应，已知MG菌落为阳性结果 发应证明该分物为鸡败血支原体。 时，试验成立。若第块载玻片分离 5.2.2PCR鉴定 5.2.2.1材料准备 5.2.2.1.1 仪器设备 PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、高速冷冻离心机、水浴锅、移液器、核酸蛋白分析仪。 5.2.2.1.2试剂材料 除另有规定外，所有实验使用的试剂等级应为不含DNA和DNase的分析纯或生化试剂。实验用 水应符合GB/T6682级水的规格，去离子水电阻应达到18.2M2。 双蒸水、琼脂糖、溴化乙锭、TBE缓冲液、上样缓冲液、相对分子质量Marker(DL-2000*）。 2 SN/T1224—2012 5.2.2.1.2.2MG扩增引物： 上游引物(MG-F):5'-GAG-CTA-ATC-TGT-AAA-GTT-GGT-C-3" 下游引物(MG-R):5'-GCT-TCC-TTG-CGG-TTA-GCA-AC-3" MS扩增引物： 上游引物(MS-F):5'-GAG-AAG-CAA-AAT-AGT-GAT-ATC-A-3" 下游引物（MS-R):5-CAG-TCG-TCT-CCG-AAG-TTA-ACA-A-3 5.2.2.2样品DNA的提取 将样品直接10000r/min4℃离心10min，取沉淀以PBS洗涤数次，于沸水中裂解10min，再 10000r/min4℃离心10min。 5.2.2.3PCR扩增 检测过程应同时做阳性和阴性及空白对照。 PCR反应体系： 10XPCR缓冲液 5. 0 μL dNTP(10 mmol/L) 1.0 μL MgCl2(50mmol/L) 2. 0 L 上游引物（20pmol/μL）0.5L 下游引物（20pmol/μL）0.5L 0. 25 μL Taq酶(5U/μL) 模板DNA 5.0 μl 加超纯水至 50μL PCR扩增参数：95℃预变性5min；94%变性30s，55℃退火30s,72℃延伸60s，40个循环；最后 72℃延伸5min。 5.2.2.4PCR扩增产物电泳检测 用TBE缓冲液制备1.5%琼脂糖凝胶加人EB至终浓度为0.5μg/mL（也可在电泳后进行染色）。 取5μLPCR扩增产物与2uL上样缓冲液混合后加人点样孔进行电泳，电压5V/cm～9V/cm，20min~ 30min。用凝胶成像仪观察分析电泳绍 结果。 5.2.2.5结果判定 当MG阳性对照扩增出186bp，MS阳性对照扩增出211bp，阴性空白对照孔未见有PCR扩增条 带，表明试验成立，否则应重做。 样品用MG扩增引物扩增如发现有186bp大小的条带，则判定检样中含有MG，用MS扩增引物 扩增发现有211bp大小的扩增条带，则判定检样中含有MS，否则判为阴性；对该扩增产物作进步的 酶切鉴定或测序鉴定进行确认。 5.2.2.6产物鉴定 PCR扩增若产生约186bp或211bp的基因片段，可利用胶回收试剂盒回收扩增产物，并采用AvaI 限制性内切酶进行酶切或直接进行测序，MG扩增片段酶切产物大小分别为110bp和76bp，MS扩增 片段酶切产物大小分别为124bp和77bp，扩增片段核酸序列参见C.2。 3 SN/T1224-2012 5.3血清学诊断 5.3.1快速血清凝集试验 5.3.1.1从鸡群采集的血清样品，4℃保存，于72h内在室温下进行试验。 5.3.1.2在干燥洁净的白瓷反应板或载玻片上滴加一滴（20uL)待检血清，再滴加等量的染色抗原在 待检血清上，转动反应板使血清与抗原混合均匀。鸡血清或火鸡血清在2min内出现凝集。 5.3.1.3设立阳性血清和阴性血清作对照试验。 5.3.1.4结果判定：当待检血清在2min内发生凝集反应的则判为阳性，阴性、阳性结果参见C.3。 5.3.2免疫胶体金检测方法 100μL；或者将血清样品用8%生理盐水稀释20倍后，取100μL置于酶标板孔内。 5.3.2.2操作方法：取出试剂盒，室温平衡20min，打开包装袋，取出试纸条，将试纸条的样品垫端没 人制备好的样品中，10min内判定结果。 5.3.2.3结果判定： 当阳性对照血清试纸条出现肉眼可见的紫红色质控线和检测线，阴性对照血清试纸条出现肉眼可 见的紫红色质控线而没有出现肉眼可见的紫红色检测线，表明试验成立；否则，应重新试验，如仍不产生 质控线，表明试纸条失效，应废弃。 试样试纸条出现肉眼可见的紫红色质控线，同时也出现肉眼可见的紫红色检测线，结果判定为阳 性，记为“十”；反之，如试纸条只出现质控线，而没有出现检测线，则结果判定为阴性，记为“一”；检测线 颜色越深说明被检血清抗体水平越高。 5.3.3血凝抑制试验 5.3.3.1血凝试验 5.3.3.1.1于90°V型微量血凝