行业文档 SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T1446---2010 代替SN/T1446.1----2004,SN/T1446.2--2006,SN/T16972006 猪传染性胃肠炎检疫规范 Quarantine protocol for transmissible gastroenteritis of swine 2010-05-27发布 2010-12-01实施 中华人和国 发布 国家质量最监督检检疫总局 数码防伪 SN/T 1446--2010 本标准按照GB/T1.1--2009给出的规则面草。 本标准代替SN/T1446.1--2004《猪传染性胃肠炎阻断酶联免疫吸附试验》、SN/T1446.2--2006 《猪传染胃肠炎血清中和试验操作规程》SN/T1697- 2006《猪传染性胃肠炎病毒和猪呼吸道冠状病 毒抗体阻断ELISA鉴别试验操作规程》。 本标准参照国际动物卫生组织（OIE）的《ManualofDiagnosticTestsandVaccinesforTerrestrial Animals》CHAPTER2.8.11（诊断试验和疫苗标准手册，2008年版）及有关标准、文献制定。 本标准山国家认证认可监督管理委员会提出并。 本标准起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：李健、张强、王巧全、廊璐、熊炜、蒋静、胡永强。 本标准所代替标准历次版本发布情况为 SN/T 1446.1.--2004; SN/T1446.2-2006; -SN/T1697-2006。 SN/T1446---2010 猪传染性胃肠炎检疫规范 范围 本标准规定了猪传染性胃肠炎的现场检疫、猪传染性胃肠炎病毒检测的病毒分离鉴定、直接免疫荧 光法、双抗体夹心酶联免疫吸附试验、反转录聚合链式反应及血清抗体检测的微量血清中和试验、阻 断酶联免疫吸附试验操作的技术要求 本标准适用于猪传染性胃肠炎的诊断、进出！检疫及流行病学调查等。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的：凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本 文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 18088 出人境动物检疫采样 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 3.1 TGEV 猪传染性胃肠炎病毒。 3. 2 TCUDSO 组织培养半数感染量。 3.3 CPE 细胞病变。 3.4 OD值 光密度值。 3.5 PBS 磷酸盐缓冲液。 3.6 RNA 核糖核酸。 3. 7 Vero细胞 非洲绿猴肾细胞。 食品伙伴网http e.net SN/T1446-2010 3.8 PK15细胞 猪肾细胞。 3.9 ST细胞 猪睾丸传代细胞。 4临床诊断 4.1发病症状 一般2周龄以内的仔猪感染后12h～24h会出现呕吐，继而出现严重的水样或糊状腹泻，粪便呈 黄色，常夹有未消化的凝乳块，恶臭，体重迅速下降，仔猪明显脱水，发病2d～7d死亡，死亡率达 100%；在2周龄～3周龄的仔猪，死亡率在0·10%。断乳猪感染后2d～4d发病，表现水泻，呈喷射 状，粪便呈灰色或褐色，个别猪呕吐，在5d-8d后腹泻停止，极少死亡，但体重下降，常表现发育不良， 成为僵猪。有些母猪与患病仔猪密切接触反复感染，症状较量，体温升高，泌乳停正，呕吐、食欲不振和 腹泻，也有些哺乳母猪不表现临诊症状。在冬春季节。猪只发生水样腹泻、呕吐，尤其是2周龄仔猪发病 率和死亡率高等特点可以作出初步诊断。但猪流行性腹泻病毒（PEDV），轮状病毒（PRTV)等肠道病 毒也常常引起类似的猪腹泻临诊症状。所以仅仅依靠临诊症状作为TGE诊断的依据是不足的，应进 行病原学和血清学方法的诊断，才能确诊。 4.2病理变化 TGE病毒通过消化道和呼吸道入侵机体。摘毒经口咽，食管，胃进人消化道，在小肠上皮细胞发生 感染，导致空肠和回肠的绒毛显著萎缩。本病的潜伏期很短，一般为12h～18h，仔猪发病后往往表现 为严重脱水而死亡。主要的病理变化为急性肠炎，从胃到直肠可见程度不一的卡他性炎症。胃肠充满 凝乳块，胃黏膜充血；小肠充满气体。肠壁弹性下降，管壁变薄，呈透明或半透明状；肠内容物呈泡沫状、 黄色、透明；肠系膜淋巴结肿胀，淋巴管没有乳糜。心、肺、肾未见明显的病理肉眼病变。病理组织学变 化可见小肠绒毛菱缩变短，甚至坏死，与健康猪相比，绒毛缩短的比例为1：7；肠上皮细胞变性，黏膜固 有层内可见浆液性渗出和细胞浸润。肾由于曲细尿管上皮变性尿管闭塞而发生浊肿，脂肪变性。电子 显微镜观察，可看到小肠上皮细胞的微绒毛、线粒体、内质网及其他细胞质内的成分变性，在细胞质空泡 内有病毒粒子存在。 4.3流行病学 猪对TGE病毒最为易感。各种年龄的猪都可感染：而猪以外的动物如狗、猫、狐狸、燕八哥等不致 病，但它们能带毒、排毒。血清学调查表明TGE的阳性率在不同的国家和地区猪群中不同。TGE病 毒的储存宿主至少有四种，第-种是病毒扩散量业脂床症状的猪场，如育肥猪场或不断有新生仔猪的 猪场，TGE病毒可持续存在于这些猪场。·日且到了发病的适应季节。即可引起本病的爆发。第二种是 狗、猫、狐狸、燕八哥、苍蝇等带毒、排毒、机械的传播本病：第三种是带毒猪或发病猪通过鼻内分泌物、粪 便、乳汁排毒；第四种是感染了TGE病毒的动物本。业已证明，血液和屠宰后的废弃物可将TGE病 毒传人猪群。在病毒毒血症期屠宰猪的肉也能传罐病毒。 根据不同年龄猪的易感性，TGE可呈三种流行形式。其呈流行性，对于易感的猪群，当TGE病 毒入侵之后，常常会迅速导致各种年龄的猪发病：尤其在冬季，大多数猪表现不同程度的临诊症状；其二 2 食品伙伴网http： e.net SN/T1446---2010 呈地方流行性，局限于经常有仔猪出生的猪场或不断增加易感猪如肥育猪的猪场中。虽然仔猪能从免疫 后或从母猪乳汁中获得被动免疫，但受到时间和免疫能力的限制，当病毒感染力超过猪的免疫力时，猪 将会受到感染。所以TGE病毒长期存在于这些猪群中；其三呈周期性流行，常发生于TGE病毒重新 侵人有免疫母猪的猪场，由于前一冬季感染猪在夏天或秋天已被屠宰。新进的架子猪和出栏猪便成为易 感猪。 5实验室诊断 5.1采样 5.1.1 采样标准 对该病的进一步诊断需要进行病毒分离鉴定、分子生物学或血清学检查等。 按GB/T18088规定采样，并按规定填写《送样单》送实验室。 5.1.2 病料的采集 取病猪粪便或仔猪肠内容物。死亡猪采小肠，两端扎住，取其内容物及小肠用于病毒检测。样品应 新鲜或冷藏。 5.1.3血样的采集制备 无菌操作采集动物血，每头不少于10mI。自然凝固后无菌分离血清，分装，加盖密封后冷藏保存。 5.2病毒分离鉴定 5.2.1i 设备、材料和试剂 本标准所用水应符合GB/T6682中二级水的规格。下列试剂除特殊规定外，均指分析纯试剂。 5.2.1.1 TGEV、标准阳性、标准阴性血清：由指定单位提供。 5.2.1.2 细胞：仔猪肾原代细胞或PK15、ST细胞。 5.2.1.3 特牛血清：不含细菌、支原体，56℃灭活30min。 5.2.1.4 培养液、维持液、细胞分散液、PBS缓冲液：见附录A。 5.2.1.5 生物安全柜。 5.2.1.6 倒置显微镜。 5.2. 1.7 二氧化碳培养箱。 5.2.1.8 可调单头微量移液器（50μL~200μl，50μL~1000μL）。 5.2.1.9 冷冻离心机。 5.2.2 病料处理 将采集的小段空肠剪碎及肠内容物或粪便，用含青霉素10000IU、链霉素10000μg/mL的pH7.2磷 酸盐缓冲液（PBS)液（见附录A第A.1章）制成5倍悬液，超声波裂解处理后4℃条件下3000r/min离心 30min，取上清液，经0.22um微孔滤膜过滤，分装，一20C保存备用。 5.2.3操作步骤 按常规方法制备仔猪肾原代细胞或PK15、ST细胞单层。将病料过滤液（病毒培养液的10%）接种 3 食品伙伴网htt net SN/T 1446--2010 到已形成良好单层的细胞上，37℃吸附1h后补加病毒培养液。置37℃5%二氧化碳培养箱培养，逐 日观察细胞病变（CPE)，连续3d~4d。若仍不出现细胞病变，则收取培养物继代于新制备的细胞上盲 传3代。出现细胞病变者，收取培养物.保存于70℃以下待鉴定。同时设立未接种的细胞对照。 5.2.4结果判定 5.2.4.1对照组细胞正常，接种样品的细胞育传3代后无细胞病变者，判为阴性。 5.2.4.2本病毒CPE变化的特点：细胞颗粒增多，圆缩，呈小堆状或葡萄串样均匀分布，细胞破损，脱 落。对不同细胞培养物，CPE可能有些差异 5.2.4.3出现上述病变的细胞培养物.需要选择直接荧光法、双抗体夹心酶联免疫吸附试验、反转录聚 合酶链式反应做进一步病毒鉴定。 5.3直接免疫荧光法 5.3.1设备、材料和试剂 本标准所用水应符合GB/T6682中二级水的规格。下列试剂除特殊规定外，均指分析纯试剂。 5.3.1.1TGE荧光标记抗体（FA）：出指定单位提供。 5.3.1.2TGEV阳性、阴性对照片：由指定单位提供，-20C保存。 5.3.1.30.1%伊文斯蓝原液、磷酸盐缓冲甘油：见附录A第A.2章。 5.3.1.4 荧光显微镜。 5.3.1.5 冰冻切片机。 5.3.1.6 可调单头微量移液器（50uL～200uL.50uL1000μL）。 5.3.2采样、送检和处理 从急性病例采取空肠（中段）、扁桃体、肠系膜淋巴结任选一种组织，慢性、隐性感染