中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 2434—2010 贝类包拉米虫病检疫技术规范 Protocol of quarantine for Bonamiosis in shellfish 2010-01-10发布 2010-07-16实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 数码防伪 SN/T24342010 前 言 本标准非等效采用了国际动物卫生组织（OIE)编写的水生动物疾病诊断手册（2006版）中2.2.1 INFECTIONWITHBONAMIAOSTREAE和2.2.1INFECTIONWITHBONAMIAEXITIOSA 等有关章节。 本标准的附录A和附录B为规范性附录，附录C和附录D为资料性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准主要起草单位：中国检验检疫科学研究院。 本标准参加起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检 疫局、中华人民共和国福建出入境检验检疫局、中华人民共和国黄岛出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：吴绍强、林祥梅、刘莊、岳志芹、刘建、郑腾、李西峰、韩雪清、贾广乐、梅琳、 王彩霞。 本标准为首次发布的出入境检验检疫行业标准。 SN/T 2434—2010 贝类包拉米虫病检疫技术规范 1范围 本标准规定了包拉米虫病检疫时的样品采集、组织印迹、病理切片以及PCR检测时的操作规程。 本标准适用于牡蛎等水生动物及其产品中携带牡蛎包拉米虫（Bonamiaostreae）、包拉米原虫 (Bonamiasp)等包拉米虫的检疫，也可用于养殖场包拉米虫病的监测。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18088出人境动物检疫采样 SN/T1193基因分析检测实验室技术要求 3术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3.1 包拉米虫病Bonamiasis;Bonamiosis 由牡蛎包拉米虫（Bonamiaostreae）、包拉米原虫（Bonamiasp）等在宿主血细胞内寄生或者游离在 结缔组织、鳃、内脏或套膜上皮中而引起的水生动物的一种严重的寄生虫病。 3. 2 SSUrDNA 小亚基核糖体DNA，为生物物种较为保守的DNA片段，常被作为物种分类及鉴定的依据。 4概述 包拉米虫病是严重危害世界贝类养殖业的主要疾病，也是OIE规定的贝类必报疫病之一。病原为 包拉米虫，现发现的包拉米虫包括五个种，除主要寄生在欧洲牡蛎体内的牡蛎包拉米虫（B.ostreae)外， 还有寄生在悉尼牡蛎体内的B.roughleyi、欧洲牡蛎体内的B.eritiosa、美国牡蛎体内的B.perspora、 澳大利亚牡蛎体内的B.SP。天然宿主包括欧洲牡蛎、新西兰牡蛎、阿根廷牡蛎、葡萄牙牡蛎、中国鹑螺， 不能感染太平洋巨蛎、美洲牡蛎、河蚌等贝类。感染后症状主要表现为闭合肌萎缩、退色成黄色，颗粒性 白细胞增生，出现灰白色小溃疡或穿孔性溃疡、血细胞破裂、血球渗出。性腺、套膜、鳃出现大范围损伤， 并最终导致死亡。 5材料 除另有规定外，所用化学试剂均为分析纯。试验用水要求达到GB/T6682中一级水的要求。 5.1涂有氨基烷基硅烷（aminoalkylsilane)粘附剂的载玻片、 5.2姬姆萨染液、苏木精-伊红染色液、伊红染液、返蓝液、Davidson's固定液等，配制方法见附录A。 5.3DNA抽提所需要的相关试剂或其他商品化组织DNA提取试剂盒，见附录B。 5.4PCRbuffer、硫酸镁、dNTP(2.5mmol/L或10mmol/L）、DNA聚合酶、DNAMaker、电泳上样缓 SN/T2434—2010 冲液等，均为商品化试剂盒中成分。 5.5电泳缓冲液：配制方法见附录A。 5.6二甲苯、封片树胶。 5.7 无水乙醇。 5.8 琼脂糖。 6 设备 6. 1 生物安全柜。 6.2 PCR仪。 6.3 电泳仪。 6. 4 凝胶成像仪或紫外透射仪。 6.5 生物显微镜。 6.6 一80℃的超低温冰箱、一20℃普通冰箱、4℃冰箱。 6.7 高速冷冻离心机。 6.8 组织研磨器。 6. 9 高压灭菌锅。 6. 10 水浴锅。 6. 11 制冰机。 6. 12 微量移液器及配套的吸头 检测方法 7 7.1买 采样 7.1.1采样点的选择 应根据实际情况，一个区域的一 个种群至少选取3个采样点，大范围的几块不连续地区养殖易感品 种，应增加采样点。 采样按照GB/T18088规定方法进行。 7.1.2采样技术要求 7.1.2.1有临床症状的牡蛎 至少挑选10条濒死的或可疑的个体。采样时牡蛎应当是活的，牡蛎应当在活体或杀死后分别包装 放在密封冷藏的容器中送到实验室。所采集的样品应严格避免冰冻。在感染早期一般取牡蛎的心室， 在感染中、后期主要采集牡蛎的鳃、结缔组织、套膜上皮、消化道、性腺及胃。 7.1.2.2无临床症状的牡蛎 应采集达到统计学显著意义数量的牡蛎样品。当养殖场的个体有怀卵时，应每年在产卵期采集一 次精液或卵液。如怀卵群体由不同年龄的牡蛎个体组成，应选取两岁龄的牡蛎采样。样品应包括该地 所有的易感品种。 对无临床症状的牡蛎，取其心室、鳃、性腺等。 7.1.2.3监测目的的采样 监测时间应选在一年中最能观察到临床症状并能检测到该虫的温度和季节。每次采样的牡蛎数量 要以感染率等于或大于2%时检出的概率进行抽样。最常见的情况是应采集150个以上牡蛎。 7.1.3样品保存及运送 采取的样品应在取样后24h内送入实验室，要附有标签，清楚标明采样地点、来源和养殖历史。 7.2组织印迹法 7.2.1组织样品的选择 选取成年活牡蛎的鳃、卵囊、心室。 2 SN/T2434—2010 7.2.2制片 将所取组织用吸纸吸去多余的水分后，用镊子将组织在载玻片上轻轻积压涂片，在载玻片上形成薄 层膜，自然风干，丙酮或甲醇固定印迹，滴加姬姆萨（Giemsa）染液4滴～5滴，固定1min，然后按 1：1～1：2的比例加缓冲液（pH6.4～6.8的磷酸盐缓冲液）用洗耳球吹匀，染色5min~10min，流水 冲洗，晾干，置于1000×显微镜上观察。 7.2.3结果判定 虫体呈球形或卵圆形，通常大小在2μm～5um。细胞质染成浅蓝色，细胞核染成红色。多寄生在 血细胞内，感染严重时，血细胞外也有寄生（虫体形态特点参见附录C)。 7.3病理切片技术 7.3.1组织样品的选取 活着或刚死的牡蛎组织鳃、套膜、性腺等。 7.3.2样品前处理及制片 7.3.2.1样品的固定 用Davidson's固定液固定样品，固定液与组织块的体积比应为10：1，固定时问应在24h以上。 7.3.2.2石蜡切片制备 具体操作流程及溶液配制见附录A 7.3.3结果判定 虫体呈球形或卵圆形，通常大小在2μm5μm。细胞质染色嗜碱性，细胞核染色嗜伊红性，多寄生 在血细胞内，感染严重时，血细胞外也有寄生。此方法不能检测到感染包拉米虫的潜伏期。虫体形态参 见附录C。 7.4PCR检测方法 7.4.1材料 选取活着或刚死的牡蛎组织鳃、套膜性腺等 7.4.2操作步骤 7.4.2.1DNA的提取 实验室操作按照SN/T1193的要求进行 从采取的牡蛎样品中抽取[25mg样品，剪碎后参见附录B中提取组织DNA的方法提取待检组织 基因组DNA，也可采用商品化的组织基因组DNA/提取试剂盒进行。除检测样品外，需要设立如下 对照： 取已知感染包拉米虫的牡蛎组织作为阳性对照： 一取未患病的牡蛎个体组织作为阴性对照。 7.4.2.2引物 针对包拉米虫SSUrDNA基因设计，具体序列为： BO:5*-CATTTAATTGGTCGGGCCGC3" BOAS:5'-GGGGGATCGAAGACGATCAG3' 预期扩增片段长度为300bp，引物合成后采用灭菌ddHz0均稀释为10μmol/L。 包拉米虫PCR目标扩增序列参见附录D。 7.4.2.3反应体系 在PCR管内，加人10×PCRBuffer2.5μL,5U/μLTaqDNA聚合酶0.5μL,10μmol/L上下游 引物各0.5μL，10mmol/LdNTPs2μL，模板DNA2μL，补充ddH0至25μL。 7.4.2.4扩增程序 94℃预变性5min；之后94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环；最后 72℃补充延伸10min。 3 SN/T 2434—2010 7.4.2.5 琼脂糖电泳 取5μL样品PCR扩增产物，进行1%～2%的琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后，用凝胶成像仪或者紫 外透射仪观察结果。 7.4.3结果判定 7.4.3.1试验成立的条件 只有阳性对照有300bp的扩增条带，同时阴性对照没有相应片段的PCR产物时，才可判定本次试 验成立，否则本次试验无效，需分析并排除引起试验无效的因素，并重新试验。 7.4.3.2样品检测结果 在阳性、阴性对照都成立的前提下，若检测样品有300bp的条带，则判定样品包拉米虫PCR检测 结果阳性，若检测样品无300bp的条带，则判定样品包拉米虫PCR检测结果阴性。 8结果综合判定 8.1可疑判定 特定宿主动物组织通过病理组织切片、组织印迹、PCR检测，只要某一项结果为阳性，则判为可疑。 8.2确诊判定 对于可疑病例，需进行PCR结合PCR产物测序作出确诊。 SN/