行业文档 SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T2552.11-2010 乳及乳制品卫生微生物学检验方法 第11部分：蜡样芽杆菌的分离与计数 Microbiological examirnatidu fnr milk and milk products hygiene- Part 11:Isolation and cmummeration of Bacillus cereus 2010-05~27发布 2010-12-01实施 人成翼和 发布 国家质量督验检度总 数码防伪 SN/T2552.11--2010 前 言 SN/T2552《乳及乳制品卫生微生物学检验方法》分为十三个部分： 第1部分：取样指南； 第2部分：检验样品的制备与稀释； 第3部分：酵母、霉菌菌落计数； 第4部分：嗜冷菌微生物菌落计数； 第5部分：沙门氏菌检验； 第6部分：柠檬酸杆菌检验； 第7部分：阴沟肠杆菌检验； 第8部分：普通变形杆菌和奇异变形杆菌检验； -第9部分：克雷伯氏菌检验； -第10部分：阪崎肠杆菌检验 免疫荧光决 第11部分：蜡样芽孢杆菌的分离与计数； 第12部分：单核细胞增生李斯特氏菌检测与计数； 第13部分：假单孢菌属的分离计数。 本部分是SN/T2552的第11部分。 本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。 本部分参照了ISO7932《食晶和动物饲料微生物学凝似蜡样芽孢杆菌计数水平方法30℃菌落 计数技术》(ISO7932Microbiologyof foodandanimal feedingstuffs--Horizontalmethodforthee- numerationof presumptiveBacillus cereus--- Colouy-counttechniqueat3odegreesC)和美国FDA《细 菌分析手册第14章蜡样芽孢杆菌》（BacteriologicalAnalyticalManual-chapter14Bacilluscereus）。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归。 本部分起草单位：中华人民共和国青林出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。 本部分主要起草人：王振国、罗雁非、蔡阳！、赵贵明、刘金华。 食品伙伴网http： SN/T 2552.11---2010 乳及乳制品卫生微生物学检验方法 第11部分：蜡样芽跑杆菌的分离与计数 1范围 SN/T2552的本部分规定了乳及乳制品中蜡样芽孢杆菌的分离与计数方法。 本部分适用于乳及乳制品中蜡样芽孢杆菌的分离与计数。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 乳及乳制品卫生微生物学检验方法 第1部分：取样指南 SN/T2552.1 第2部分：检验样品的制备与稀释 SN/T2552.2乳及乳制品卫生微生物学检验方法 SN/T1538.2-2007培养基制备指南 第2部分：培养基性能测试实用指南 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3. 1 蜡样芽孢杆菌 Bacilluscereus 种需氧革兰氏阳性芽孢杆菌，普遍存在于工壤、蔬菜及生品和熟品食物中，繁殖能力强，它是导致 食物中毒的常见致病微生物 4原理 4.1 分离。 4.2利用蜡样芽孢杆菌的溶血特性。接种绵羊血琼脂平板进行二次筛选。 4.3 将疑似菌落纯化后初步进行生化确证，鉴定到蜡样芽孢杆菌群。 4.4 通过群内生化鉴别，鉴定到蜡样芽孢杆菌种。 4.5 按确证为阳性的蜡样芽孢杆菌数计算每克或每毫升样品中的蜡样芽孢杆菌数。 5 培养基和试剂 5.1 甘露醇卵黄多粘菌素B琼脂（MYP）：见附录A第A。1章。 5.2 绵羊血琼脂：见附录A第A.2章。 5.3营养琼脂（NA)：见附录A第A.3章。 1 let SN/T2552.11—2010 5.4 酚红葡萄糖肉汤：见附录A第A.4章 5.5 硝酸盐肉汤：见附录A第A.5章。 5.6 酪氨酸琼脂：见附录A第A.6章。 5.7 溶菌酶肉汤：见附录A第A.7章。 5.8 改良培养基：见附录A第A.8章。 5.9 改良VP培养基：见附录A第A.9章。 5.10 动力试验培养基：见附录A第A.10章 6 设备和材料 6.1 干燥灭菌（烘箱）和湿热灭菌（高压灭菌器）设备。 6.2 拍打式均质器。 6.3 水浴箱：45℃±2℃。 6.4 温度计：量程1℃～55℃，分刻度0.1℃。 6.5 培养箱：30℃±1℃和35℃±1℃。 6.6 干燥橱或烘箱：37℃土1℃和55℃±1℃。 6.7 pH计：要求在25℃时精确校准到0.1pH单位。 6.8 吸管：10mL和1.0mL，分刻度分别为0.5ml和0.1mL。 6. 9 “L”型玻璃涂布棒：直径3.5mm，长20cm，一端3cm处有直角的玻璃或塑料棒；切面端应 平滑。 6.10 接种环：3mm直径。 6.11 天平：量程2000g，灵敏度0.1g。 6.12 灭菌样品处理器具：取样勺、剪刀、开罐器。 6. 13 样品稀释瓶：100ml，125mL，150ml，250mL和2L.样品稀释瓶。 6.14 平Ⅲl：小规格（直径为90mm~100mm）和（或）大规格（直径为140mm）的平Ⅲ。 6.15 厌氧罐或能够提供相同厌氧培养条件的仪器或设备。 7 蜡样芽孢杆菌检验方法 7.1方法提要 乳及乳制品中蜡样芽孢杆菌是通过选择性分离、生化鉴定等方法对乳及乳制品中可能存在的蜡样 芽孢杆菌进行定性和定量的检验。 7.2检验程序 蜡样芽孢杆菌检验程序见图1。 2 食品伙伴网http： SN/T2552.11---2010 祥品25g(ml)225ml稀释液 减10倍比稀释 ■0.1mL接种MYP平板 1mL接种MYP平板 30℃±1℃培养18h～24h，或继续培养24h 挑选可疑菌落，接种绵羊血琼脂平板 30℃±1℃培养24h±2h 探选疑鳅菌落，接种营养琼脂平板 群内种的鉴别试验 生化确认试验 染色形态学检查 撒告结果 图1 蜡样芽孢杆菌检验程序 检验步骤 取样按照SN/T2552.1执行。无菌称取样品25g加入到适当的样品稀释容器中，加入225mL 8.1 灭菌蒸馏水（1：10稀释），或者将样品直接称量到装有灭菌蒸馏水的样品稀释容器中。振荡或拍打使样 品充分混勾。混合均勾后，取10mL悬浮液于90mLpH7.4缓冲盐水中（1：100稀释），必要时采用相 同方法进一步10倍倍比稀释。其他乳制品在制样时按照SN/T2552.2执行。 8.2取2个MYP平板。分别加0.1mL液态检测样品，或0.1mL其他形态样品的初始稀释液。根据 样品的污染程度进行适当的稀释 8.3对于特定的产品，估计出最低的蜡样芽独杆菌污染量。通过将1.0mL液体样品或1.0mL其他 形态样品的初始稀释液涂布到大的培养Ⅲ（140mm）或分散涂布到3个小培养Ⅲ（90mm）来提高样品 检测浓度。在这两种情况下，需要准备2个大培养Ⅲ或6个小培养皿。 8.4将样品液涂布整个琼脂表面，避免接触平Ⅲ的边缘。每个平板应用一个新的灭菌涂布棒。平板室 温静置15min，使样品液被吸人琼脂内。 8.5待表面干燥后翻转平板于30十1℃培养18h~24h。如果菌落特征不明显，继续培养24h。 平板的计数和菌落选择：培养结束，选取合有150个菌落以内的连续两个稀释度的平板。计数每 8.6 个平板上的疑似菌落。疑似菌落为大的、粉红色（表明不发酵甘露醇，见注1)周围有粉红色晕环（表示 产生卵磷脂酶，见注2） 注1：如果平板上有许多产酸的甘露醇发酵菌落，将致蜡样芽孢杆菌的粉红色菌落特征减弱或消失。 注2：一些蜡样芽孢杆菌仅产生很少或不产生卵磷脂酶。这些菌落周围没有晕。这些菌落也应进行确认试验。 3 SN/T2552.11-2010 8.7菌落的选择和纯化：从8.6选取的每个平板上分别取3个疑似菌落。如果一个平血上少于5个典 型或疑似菌落，则取所有典型的或疑似的菌落做确认：这些菌落的确认见8.9和8.10。 于30℃土1℃的培养箱中培养18h~21h。从每个平板上至少选取-个粉红色菌落，按照8.8进行 确认。 8.8将选择的菌落采用划线、穿刺绵羊血琼脂.30℃:1.℃培养24h士2h后观察溶血现象。蜡样芽孢 杆菌溶血阳性。 8.9蜡样芽孢杆菌生化确认试验：将MYP和溶恤试验阳性菌落接种营养斜面进行纯培养，30℃土 1℃培养24h±2h。 a）厌氧条件下葡萄糖发酵试验：接种培养物于3mL酚红葡萄糖肉汤，厌氧条件下35℃士1℃培 养24h土2h。振动试管，阳性结果会出现红色到橘黄或黄色的改变； b) 硝酸盐还原试验：接种培养物于5ml.硝酸盐肉汤。35℃士1℃培养24h士2h，向每个培养管 中加入试剂A和C（见附录A第A，3章)各0.25mL。10min内出现橙色反应为阳性； c） VP试验：接种培养物于5ml.改良VP培养基，35℃11℃培养48h土2h。向1mL培养物中 加入0.6mL的α-萘酚溶液和0.2ml.的40%氢氧化钾溶液。振荡，然后加人肌氨酸粉末。室 温放置1h，出现粉红色为阳性： (P 酪氨酸利用试验：接种培养物于酪氨設琼脂斜面，3；℃土1℃培养48h土2h。酪氨酸被利用 没有生长现象，而阴性管培养7d仍然有明显生长现象； e) 溶菌酶抗性试验：接种培养物于含0。001%溶菌酶肉汤，35℃士1℃培养24h士2h。出现细菌 生长现象为阳性。 苏云金芽孢杆菌和哺乳动物致病菌炭疽芽孢杆菌。这些菌株可以通过种特异性同蜡样芽孢杆菌区别开 来。群内