SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T2705—2010 调味品中转基因植物成分 实时荧光PCR定性检测方法 Protocol of the Real-time Flucrescence qualitative polymerase chain reaction for detecting genetically modified plant components in condiments 2010-11-01发布 2011-05-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T27052010 前 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、北京望尔生物技术有限公司。 本标准主要起草人：李丹宁、高东微、钟玉清、张隽、万宇平、蔡颖、谢佩心、陈源树、庄逸林、冯才伟、 钟国强、马骏。 SN/T 2705—2010 调味品中转基因植物成分 实时荧光PCR定性检测方法 1范围 本标准规定了调味品中转基因植物成分实时荧光PCR定性检测方法。 本标准适用于以玉米、大豆、油菜籽马铃薯大米，番茄等农产品及其加工产品为原料生产的调味 品中转基因植物成分的实时荧光PCR定性检测。本标准适用的调味品按照GB/T20903，分为酱类、豆 豉、腐乳、蚝油、香辛料和香辛料调味品、复合调味料、火锅调料，具体包括豆酱、面酱、番茄酱、辣椒酱、芝 麻酱、花生酱、芥末酱，豆豉，腐乳蚝油香辛料、香辛料调味粉，鸡精调味料、鸡粉调味料、牛肉粉调味 料、海鲜调味料，风味酱、沙拉酱、蛋黄酱，火锅底料、火锅蘸料等。其他调味品参照使用。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T19495.2转基因产品检测实验空技术要求 GB/T19495.3转基因产品检测核酸提取纯化方法 GB/T19495.7转基因产品检测抽样和制样方法 GB/T20903调味品分类 GB/T27025 检测和校准实验室能力的通用要求， 植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法 SN/T1204 3术语、定义和缩略语 3.1术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 调味品condiment 在饮食、烹饪和食品加工中广泛应用的，用于调和滋味和气味并具有去腥、除腹、解腻、增香、增鲜等 作用的产品。 3.1.2 DNA的提取和纯化DNAextractionandpurification 从测试样品的各种成分中释放DNA，随后纯化DNA去除PCR反应抑制剂。 3.1.3 外源基因exogenousgene 利用生物工程技术转人的其他生物基因，使该生物品种表现新的生物学性状。 3.2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 1 SN/T2705—2010 EPSPS(5-enolpyruvylshkimate-3-phosphatesynthasegene）：5-葬草酸-3-磷酸合酶基因 FAM(6-carboxyfluorescein)：6-羧基荧光素 GOS(A root-specific rice gene highly expressed in roots from seedlings and mature plants which encodesa14kDaprotein）：编码一个14kDa蛋白质、在幼苗和成熟植株根部高度表达的水稻种属特异 性基因 LA（linearacrylamide）：线状丙烯酰胺 NOS(terminatorofnopalinesynthasegene）：胭脂碱合酶基因终止子 TAMRA（carboxy-tetramethyl-rhodamine）：羧基四甲基罗丹明 tRNALeu：叶绿体亮氨酸转运核糖核酸基因 4方法提要 调味品多属于深加工食品，一方面DNA在食品加工过程中受到破坏，另一方面调味品可能富含 盐、糖、蛋白质、发酵产生的有色物质等，这些因素均会影响DNA提取纯化和PCR检测效果。本标准 应用CTAB-LA协同沉淀和低温差速离心等实验技术，对调味品中的植物基因组DNA进行分离、纯化 和浓缩，使之适用于TaqMan实时荧光PCR检测技术，通过检测其中是否含有各种外源基因，达到对调 味品中转基因植物成分定性PCR检测的目的。 5 材料与试剂 5.1 设备和材料 5.1.1 高速冷冻离心机：最高转速18000r/min。 5. 1.2 台式离心机：最高转速18000r/min。 5. 1.3 微型个人离心机。 5.1.4 5.1.5 制冰机。 5.1.6 0.08-0.02-0.8~0.7 5.1.7 核酸真空干燥系统。 5.1.8 核酸蛋白分析仪。 5. 1.9 实时荧光PCR仪。 5.1.10 离心管：1.5mL、2mL、15mL、50mL。 5.2试剂 5.2.1 除另有规定外，所有实验使用的试剂等级应为不含DNA和DNase的分析纯或生化试剂。条件 许可的情况下推荐使用优级纯试剂。试剂的选购、验收、储存应符合GB/T27025规定。实验用水应符 合GB/T6682中一级水的规格。去离子水电阻应达到18.2Q。 5.2.2植物基因组DNA纯化试剂盒"。 5.2.310XPCR缓冲液（不含氯化镁）。 5.2.4 氯化镁溶液：25mmol/L。 5.2.5 dNTP溶液(dATP、dCTP、dGTP、dTTP或dUTP)：各2.5mmol/L。 植物基因组DNA纯化试剂盒由北京望尔生物技术有限公司提供。给出这一信息是为了方便本标准的使用者， 并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 2 SN/T2705—2010 5.2.6 UNG酶（以dUTP代替dTTP时）） 5.2.7 Taq酶。 5.2.8 引物和探针：调味品中转基因植物成分实时荧光PCR定性检测所用引物序列和探针序列见 表1。 实时荧光PCR所用引物和探针序列 检测基因 引物序列 探针序列 备 注 5'-tgaacccatgcatgcagt-3" ZEIN 5'-tggcgtgtccgtccctgatgc-3* 玉米内源基因 5'-ggcaagaccattggtga-3" 5'-cctcctcgggaaagttacaa-3" Lectin 5'-ccctcgtctecttggtcgcgccctct-3" 大豆内源基因 5'-gggcatagaaggtgaagtt-3" 5'-ccagttcttggagccgcttga-3* PE3-PEPcase 5'-caggtcgctatgcgactgcggagaca-3" 油菜籽内源基因 5'-aagggccagtccaaatgcaga-3 5'-ttagcctcccgetgcaga-3" GOS 5'-cggcagtgtggttggtcttcegg-3 大米内源基因 5'-agagtccacaagtgctcccg-3" 5'-cgaaatcggtagacgctacg-3* tRNALeu 5'-gcaatcctgagccaaatcc-3" 高等植物内源基因 5'-ttccattgagtctctgcacct-3 5'-cgacagtggtcccaaaga-3 CaMV35S 5'-tggacccacccacgaggagcatc-3* 外源基囚 5'-aagacgtggttggaacgtcttc-3 5'-aagacatccaccgaagactta-3 FMV35S 5'-tggtccccacaagccagctgctcga-3" 外源基因 5'-aggacagctcttttccacgtt-3" 5'-atcgttcaaacatttggca-3' NOS 5'-catcgcaagaccggcaacagg-3' 外源基因 5'-attgcgactctaatcata-3' 5'-aggatetegtcgtgacccat-3" NPTII 5'-cacccagccggccacagtcgat-3' 外源基因 5'-gcacgaggaagcggtca-3" 5'-acaagcacggtcaacttcc-3 Bar 外源基因 5'-actcggccgtccagtcgta-3' 5'-gtcgacatgtctccggagag-3" PAT 5'-tggccgcggtttgtgatatcgttaa-3 外源基因 5'-gcaaccaaccaagggtatc-3* 5'-gtcttcgtgttgctggaaccgtt-3" GOX 外源基因 5'-gaactggcaggagcgagagct-3' 5'-cgcgactggatcaggtaca-3" 5'-ccgccgcgagctgaccctgaccgtg-3 CryIA(b) 外源基因 5'-tggggaacaggctcacgat-3 5'-gggaaatgcgtattcaattcaac-3' CryIA(c) 5'-acatgaacagcgccttgaccacagc-3 外源基因 5'-ttctggactgcgaacaatgg-3" UNG酶在活化条件下可以降解含有dU的双链或单链DNA。在PCR扩增反应液中加人UNG酶可以有效防 2） 止以前以dUTP代替dTTP合成的PCR扩增产物所致的遗留污染。 3 SN/T2705—2010 表1(续) 探针序列 备 注 检测基因 引物序列 5'