SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 2713—2010 贝类马尔太虫检疫技术规范 Quarantine protocol for Marteilia refringens in shellfish 2010-11-01发布 2011-05-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 中华人民共和国出人境检验检疫 行业标准 贝类马尔太虫检疫技术规范 SN/T 2713—2010 * 中国标准出版社出版 北京复兴门外三里河北街16号 邮政编码：100045 网址www.spc.net.cn 电话：6852394668517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 * 开本880×12301/16 印张1字数24千字 2011年3月第一版2011年3月第一次印刷 印数1—1600 * 书号：155066·2-21649 9定价18.00元 SN/T 2713—2010 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准非等效采用了国际动物卫生组织（OIE《水生动物疾病诊断手册》（2009版）中2.4.4等有关 章节。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国山东出人境检验检疫局、中华人民共和国厦门出人境检验检疫 局、中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人：岳志芹、方绍庆、邓明俊、孔繁德、吴绍强、赵玉然、郑小龙、梁成珠、徐淑菲、 徐彪、朱来华、肖西志 I SN/T 2713—2010 贝类马尔太虫检疫技术规范 1范围 本标准规定了折光马尔太虫的检疫技术规范 本标准适用于折光马尔太虫的分离和鉴定，也适用于该病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3设备和材料 3.1设备 3.1.1 普通光学显微镜。 3.1.2 组织研磨器。 3.1.3 切片机。 3.1.4 PCR仪。 3.1.5 凝胶成像仪或紫外观察灯。 3.2材料 3.2.1 水：组织切片时用的水为75%的盐水。做PCR时所用的水要用超纯水。用水符合GB/T6682 规定。 3.2.2 干净的盖玻片、载玻片（若干）。 3.2.3 涂有氨基烷基硅烷（aminoalkylsilane）粘附剂的载玻片。 3.2.4 染色剂：常规涂片及组织学染色剂（见附录A）。 3.2.5酉 酚-三氯甲烷抽提法方法或其他DNA抽提试剂盒提取组织DNA（见附录A）。 3.2.6 蛋白酶K。 3.2.7 硫酸镁（MgSO4）。 dNTP。 3.2.8 3.2.9 TaqDNA聚合酶及PCR缓冲液。 3.2.10DNA DL2000 Marker。 3.2.11 核酸染料-EB（或者新型替代染料如：GENEFINDER）。 3.2.12俾斯麦棕（bismarckbrownyellow）染液 3.2.13电泳缓冲液（见附录A）。 3.2.14引物 Pr4:5'-CCG-CAC-ACG-TTC-TTC-ACT-CC-3' Pr5:5"-CTC-GCG-AGT-TTC-GAC-AGA-CG-3 1 SN/T 2713—2010 SS2:5'-CCG-GTG-CCA-GGT-ATA-TCT-CG-3 SAS2:5-CGA-ACG-CAA-ATT-GCG-CAG-GG-3 3.2.15Davidson's固定液（见附录A）。 3.2.1620XSSC缓冲液（见附录A）。 3.2.1750XDenhardt's溶液（见附录A）。 3.2.18PCR产物纯化试剂盒。 3.2.19地高辛标记试剂盒。 4采样（以牡蛎为例其他贝类参照此法） 4.1临床采样 挑选至少10只死的或带有疑似临床症状的活牡蛎个体（2年龄），在活体或刚死后分别包装放在 4.2监测采样 4.2.1通用要求 当个体怀卵时，应每年在产卵期采集一次卵液。对无临床症状的牡蛎：取其唇的触须和胃、消化道 上皮及粪便；成熟雌蛎还需取其卵巢液。样品应包括该地所有的易感品种（参见附录B）。 4.2.2监测初期的采样要求 在2年内每年对该养殖场监测2次。监测时间应选在一年中最能观察到临床症状并能观察到该虫 检出的概率进行抽样。整体情况下，每次采集150个个体，对怀卵的个体，两次检查中至少有一次要在 亲牡蛎中取150份卵巢液样品。 对野生、混养的蛎群，至少两年内每年一次采集150个个体，尽可能优先采取幼龄期、老龄及和（或） 雌性卵巢液。 4.2.3监测保持期采样的要求 经实验室检测2年，无马尔太虫可疑临床症状后，每年还应连续抽检两次。每次采集的样品可减少 5马尔太虫病的检测方法（以牡蛎为例，其他贝类参照此法） 5.1总则 诊断临床感染该病的贝类的理想方法是PCR或ISH法直接检测感染组织，然后用压片法、涂片法 或组织切片法予以确诊。 5.2涂片法 5.2.1样品的采集 取开口的或刚死的牡蛎个体 2 SN/T 2713—2010 5.2.2制片前载玻片的准备 新载玻片常带有游离碱质，应用浓度为1mol/L的盐酸浸泡24h，再用清水彻底冲洗，干燥后备 用。旧载玻片要在含洗涤剂的清水中煮沸20min，再用清水反复冲洗，最后用0.95%乙醇浸泡1h，干 燥备用。使用载玻片时，不要用手触及玻片表面，保持玻片清洁、干燥、中性、无油腻。 5.2.3制片方法 取一滴消化腺粘液或粪便置载玻片的一端，以边缘平滑的推片一端，从粘液或粪便前沿方向接触粘 液或粪便，使其沿推片散开，推片与载玻片保持30°～45°夹角，平稳地向前推动，粘液或粪便即在载玻片 上形成薄层膜，滴加姬姆萨染（Giemsa）液4滴～5滴，固定1min，然后按1：（1～2）的比例加缓冲液 pH6.4～6.8的磷酸盐缓冲液）用洗耳球吹匀，染色5min～10min，流水冲洗，晾干，待检。 5.2.4镜检 把制好的涂片置于400×显微镜上观察。 5.2.5结果判定 呈阳性结果的细胞通常大小在30um～40um。细胞质染色嗜碱性，细胞核染色嗜曙红细胞性，在 细胞中出现许多折光的着色颗粒和白色的光环，并且一个细胞内有多个马尔太虫细胞。马尔太虫疫区 内的易感种的检测结果阳性通常被认为该机体感染了马尔太虫；非易感种或马尔太虫疫病区外，阳性结 果通常要进一步证实，才能下定论。 5.3压片法 5.3.1样品的采集 鲜活牡蛎个体。 5.3.2制片前载玻片的准备 与涂片法相同。 5.3.3制片方法 取一栗米大小病灶消化腺上皮、腮、触须、粪便置于载玻片中央，加入75%的盐水取另一载玻片覆 盖压紧，用力大小依组织微粒受压后向四周展平的难易而定，快速平行移动拉开，使组织微粒充分展开 形成一层薄膜后（不能让其干掉），迅速投入95%乙醇中，固定2min，取出后快速进行苏木精-伊红染色 (Haematoxylin-Eosin，HE)染色。 5.3.4HE染色 5.3.4.1二甲苯脱蜡，10min。 醇、50%乙醇，除去二甲苯，组织复水。各级3min～5min。 5.3.4.3蒸馏水洗5min。 5.3.4.4苏木素染色5min~10 min。 5.3.4.50.5%盐酸乙醇分色数秒。 5.3.4.6自来水洗约30min，使细胞核变蓝。 3 SN/T 2713—2010 5.3.4.750%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇梯度脱水。 5.3.4.80.5%伊红乙醇溶液染色1min。 5.3.4.995%乙醇分色、脱水5min。 5.3.4.10100%乙醇脱水，两次共10min。 5.3.4.11二甲苯透明10min。 5.3.4.12封片：将中性树胶滴于组织片上，加盖玻片后烘干，切片就被封固。 5.3.5镜检 把制好的涂片置于最大1000×显微镜下观察。 5.3.6结果判定 呈阳性结果的细胞通常大小在4um～40um，在唇触须和胃的上皮部位发现早期的单核细胞（参 见附录C）。马尔太虫的孢子通常分布于消化腺小管和排泄管的细胞内。折光颗粒出现在孢子形成后， 红细胞性，折光体颗粒颜色由深橙色到深红色。 尔太虫疫区外，检测结果阳性需要进一步证实，才能下定论 5.4PCR 法 5.4.1样品的采集 活牡蛎或刚死的牡蛎个体，取其消化腺上皮、腮、触须等置于一80℃冰箱中备用。 5.4.2DNA的提取 样品DNA的提取可采用动物组织基因组通用试剂盒按说明书提取，也可采用常规抽提法（见附 录A)。 5.4.3 PCR 5.4.3.1PCR反应体系 在25μL反应体系中，加入2.5μL10×PCR缓冲液，1UTaqDNA聚合酶，10μmol/LPr4、Pr5 引物各1μL，10mmol/LdNTPs1μL，50ng/μL模板DNA1μL，补充水至25μL。若检测人员使用的 是合格供应商提供的PCR试剂盒，请按照PCR试剂盒说明书操作。 5.4.3.2扩增程序 PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共30个 循环；最后72℃延伸10min。 5.4.4琼脂糖电泳 用电泳缓冲液（见附录A）制备1.5%的琼脂糖凝胶平板。将平板放入水平电泳槽，使电泳缓冲液 刚好淹没胶面。向PCR扩增产物中加人1/6体积的电泳上样缓冲液（6×上样缓冲液），混匀后加到样 品孔。在电泳时设立DNADL2000Marker做对照。5V/cm电泳约0.5h，当溴酚蓝到达一定位置时 停止。在紫外灯下或凝胶成像仪的紫外透射光下观察是否扩增出预期的特异性DNA电泳带，拍摄并 记录。