SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 2744—2010 鸭病毒性肠炎检疫技术规范 Quarantine protocol for duck virus enteritis 2011-05-01实施 2010-11-01发布 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 2744—2010 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准参考了世界动物卫生组织（OIE)发布的《陆生动物诊断试验和疫苗手册》（2009版）中2.3.7 章关于鸭病毒性肠炎的有关内容而制定： 一修改采用了OIE发布的《陆生动物诊断试验和疫苗手册》中病毒分离鉴定、PCR方法、微量血 清中和试验的技术要求； 增加了OIE发布的《陆生动物诊断试验和疫苗手册》中没有提及的荧光PCR检测方法、直接 荧光抗体试验、间接酶联免疫吸附试验 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准的起草单位：中华人民共和国吉林出人境检验检疫局、中华人民共和国天津出人境检验检 疫局。 本标准主要起草人：孟日增、石建平、王建华、肖成蕊、王伟利、王振国、刘晶。 一 SN/T 2744—2010 鸭病毒性肠炎检疫技术规范 1范围 本标准规定了鸭病毒性肠炎的病毒分离与鉴定、PCR方法、荧光定量PCR方法、免疫荧光试验、微 量中和试验、ELISA等操作规程及技术要求。 本标准适用于鸭、鹅等水禽及天鹅（雁形目）鸭病毒性肠炎的诊断与检疫。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3概述 鸭病毒性肠炎（duckvirusenteritis）文称鸭瘟（duckplague），该病是由疱疹病毒科鸭瘟病毒引l起的 一种急性（有时呈慢性）鸭、鹅和天鹅（雁形目）接触性传染病，其特征为体温升高，两腿麻痹，下痫，流泪 和部分病鸭头颈肿大。食道粘膜有小出血点，并有灰黄色假膜覆盖或溃疡，泄殖腔粘膜充血出血水肿和 假膜覆盖。肝有不规则大小不等的出血点和坏死灶。本病传播迅速，发病率和病死率都很高，严重地威 胁养鸭业的发展。 鸭病毒性肠炎的诊断方法包括临床综合诊断、病原学诊断、血清学试验和分子生物学检测。 4诊断技术 4.1临床综合诊断 4.1.1临床症状 自然感染的潜伏期一般为3d～4d，鸭群突然出现持续性高死亡率，病初体温升高（43℃以上），呈 稽留热。这时病鸭表现精神萎顿，头颈缩起，食欲减少或停食，渴欲增加，羽毛松乱无光泽，两翅下垂，两 脚麻痹无力、走动困难，流泪和眼脸水肿是鸭瘟的一个特征性症状。同时病鸭下痫，排出绿色或灰白色 稀粪，泄殖腔粘膜充血，出血水肿严重者粘膜外翻。用手翻开肛门时，可见到泄殖腔粘膜有黄绿色的假 2周龄～7周龄商品维鸭表现脱水、消瘦，喙发蓝，结膜炎、流泪、鼻腔有渗出物和泄殖腔有血染等特点。 自然条件下鹅感染鸭瘟，其临床特点与鸭相似。 4.1.2病理学检查 鸭瘟眼观变化见败血症的病变，体表皮肤有许多散在出血斑，眼脸常粘连分泌干酪样物覆盖。部分 1 SN/T 2744—2010 最为严重。泄殖腔粘膜表面覆盖有一层灰褐色或绿色的坏死结痴，不易剥离，粘膜上有出血点和水肿。 产蛋母鸭的卵巢滤泡增大，有出血点和出血斑，有时卵泡破裂，引起腹膜炎。雏鸭感染鸭瘟病毒时，法氏 囊呈深红色，表面有针尖状的坏死灶，囊腔充满白色的凝固性渗出物，这些病变具有诊断意义。 组织学变化，以血管壁损伤为主，小静脉和微血管明显受损，管壁内皮破裂。具有特征性组织学变 化，见坏死的肝细胞发生明显肿胀和脂肪变性，肝索结构破坏，中央静脉红细胞崩解，血管周围有凝固性 坏死。肝细胞见有核内包涵体。脾窦充满红细胞，血管周围有凝固性坏死。食道和泄殖腔粘膜上皮细 胞坏死脱落，粘膜下层疏松，水肿，有淋巴样细胞浸润。胃肠粘膜上皮见有核内包涵体。 结合临床症状与病理学检查，可对本病作出初步诊断。 4.2病毒分离与鉴定 4.2.1材料和试剂 4.2.1.1器材 细胞培养瓶（或培养板）、吸管、移液器、二氧化碳培养箱、冷冻高速离心机、研磨器、倒置显微镜、G6 玻璃滤器、孔径0.22um微孔滤膜。 4.2.1.2水 符合GB/T6682中一级水要求。 4.2.1.3试剂 胰酶消化液、细胞生长液、细胞维持液、双抗液分别见附录A.1、A.2、A.3、A.4。 4.2.1.4实验动物 1日龄易感雏鸭、10日龄14日龄SPF鸭胚 4.2.1.5细胞 原代鸭胚成纤维细胞（DEF细胞）、原代鸭胚肾细胞（DEK）。 4.2.2病毒分离培养 4.2.2.1样品采集和运送 4.2.2.1.1样品采集 在发病早期，无菌采集病鸭血液或刮取口腔伪膜及溃疡处粘液；在动物死亡后，无菌采取肝、脾、肾 组织样品。 4.2.2.1.2运送及保存条件 立即进行实验室检测的样品，保存于4℃或置于冷藏盒中快速送达，不能立即检测的样品置于 一70℃以下条件冷冻保存待检。 4.2.2.2样品制备 血液样品应分离出血清或血浆，作为接种材料。 组织样品（肝、脾、肾），加人无血清细胞培养液，制成10%悬液，3000r/min离心15min，吸取上清 液，加入1%双抗溶液，4℃作用3h～4h（样品确定未污染可不加双抗溶液处理）后备用。污染较为严 2 SN/T 2744—2010 重的样品或可疑受污染的样品，应用0.22um的微孔滤膜进行过滤处理后作为接种材料。 4.2.2.3病毒分离方法 4.2.2.3.1接种实验动物法 选取1日龄易感维鸭16只，分成两组。一组用4.2.2.2中制备的接种材料进行肌肉接种，每只 0.5mL，另一组用同一剂量的无血清细胞培养液，隔离饲养作对照组。接种后逐日观察，连续观察 3d～12d。若对照组与接种组均无异常表现，可判定为病毒分离阴性；若对照组正常，接种组出现4.1.1中 临床表现或死亡病例，立即进行剖检检查，剖检可见4.1.1与4.1.2中的病变，可收集病料进行病毒鉴定。 4.2.2.3.2细胞培养法 按照常规方法制备DEF单层细胞（可参照附录B.1），将制备好的样品接种于24孔细胞培养板培 养的原代细胞单层，每份样本至少接种4孔，每孔0.1mL～0.2mL，37℃吸附1h，倾去多余液体，加人 1mL营养液，放人37℃的5%二氧化碳恒温培养箱中培养3d～5d。设正常细胞对照至少4孔。 样品接种24h后，于倒置显微镜下逐日观察细胞病变并作好相应记录，若细胞对照孔正常，而接种 样品孔出现细胞变圆、聚堆成簇或由于细胞脱落形成空斑等细胞病变现象时，冻融3次后转入新长满单 层的细胞培养板，如果观察仍出现类似细胞病变，且日渐明显，则可收获细胞培养物，放人一70℃冰箱 中待鉴定。 如果对照细胞与接种样品细胞均无变化，再盲传两代。盲传过程中若出现细胞病变，按上述原则， 收获细胞培养物，放入一70℃冰箱中待鉴定；若未出现细胞病变，则按未分离到鸭瘟病毒出具结果。 4.2.2.3.3鸭胚分离法 将4.2.2.2中处理好的待接种样品无菌接种于至少10枚9日龄～14日龄种鸭胚的绒毛尿囊膜 上，以后在暗室内逐日照胚观察鸭胚死亡情况并记录，弃去24h内死亡鸭胚，检查10d内死亡的鸭胚， 若呈现特征性的弥漫性出血，收集绒毛尿囊膜（CAM)待鉴定。若胚体未死亡或死亡胚体无明显病变， 则将CAM悬液盲传两代，继续观察胚体死亡及病变情况，并收集CAM及尿囊液进行病毒鉴定 4.2.3病毒鉴定 用PCR方法（见4.3）、荧光定量PCR方法（见4.4）和直接荧光抗体试验（见4.5）进行病毒鉴定。 进行病毒分离与鉴定时，要求所有样品处理应于可保证生物安全的相应级别实验室内进行操作；处 理样品使用过的容器、物品、实验材料均应经有效消毒处理后方可运离实验室， 4.3PCR方法 4.3.1试剂与材料 4.3.1.1参考毒株：DPVF34株，由指定单位提供。 4.3.1.2rTaq酶：5U/uL，保存于一20℃，避免反复冻融或温度剧烈变化，随用随取。 4.3.1.310倍PCR缓冲液：Mg²+浓度25mmol/L。 4.3.1.42.5mmol/LdNTP混合液：含dCTP、dGTP、dATP、dTTP四种脱氧核苷酸 4.3.1.5蛋白酶K：浓度为10mg/mL。 4.3.1.6引物：本试验选用保守性和特异性均好的指导DNA聚合酶合成的基因（UL31区）序列作为 PCR扩增区，设计两条引物P1、P2。引物位置和序列如下： P1(37580～37599)5′-GAAGGCGGGTATGATATGTA-3 P2(37154～37173)5'-CAAGGCTCTATTCGGTAATG-3" 3 SN/T2744—2010 P1、P2引物扩增片段为446bp。 4.3.2其他试剂 Tris碱、EDTA、SDS、苯酚、氯化钠、盐酸、乙醚和乙醇等均为市售分析纯 4.3.3器材和设备 PCR扩增仪、电泳仪、微量移液器用吸头、凝胶成像分析仪、恒温培养箱、普通冰箱、低温冰箱、组织 匀浆器或研磨器、火菌离心管、离心机等。 4.3.4操作方法 4.3.4.1样品采集与处理 4.3.4.1.1样品采集 发病可疑动物采集血液或口腔、泄殖腔拭子样品，保存于4℃或置于冷藏盒中；死亡动物无菌采集 肝、脾、肾等组织样品；胚体采集绒毛尿囊膜或收集尿囊液；细胞培养物冻融后收获。 4.3.4.1.2样品处理 组织样品需用0.01mol/LpH7.2的PBS按质量浓度配制成10%悬液，匀浆或研磨，冻融3次， 12000r/min离心5min，收集上清液备用。 拭子