QB ICS 71.100.40 分类号：Y43 备案号：37981-2013 中华人民共和国轻工行业标准 QB/T 4363-2012 牙膏中蛋黄球蛋白（IgY)活性效价测定方法 Determination of immunoglobulin egg yolk in toothpastes 2012-11-07发布 2013-03-01实施 中华人民共和国工业和信息化部 发布 QB/T4363-2012 前 言 本标准按GB/T1.1一2009进行编写。 本标准由中国轻工业联合会提出。 本标准由全国牙膏蜡制品标准化中心归口。 本标准起草单位：上海美加净日化有限公司。 本标准主要起草人：陈健芬、张琰、孙东方、李显波、孙晓青。 QB/T4363-2012 引言 1971年瑞典学者Engvail和Perlmann、荷兰学者VanWeerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检 测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法（enzyme-linkedimmunosorbentassay， ELISA）。ELISA法已被国际组织ASTM(AmericanSocietyforTestingandMetierial)公认是一种敏感性高、 特异性强、重复性好的实验诊断方法。由于其试剂稳定、易保存、操作简便、结果判断较客观等因素， 与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。本方法测定的对象是用变 形链球菌ATCC25175和亲缘链球菌ATCC0715免疫产蛋母鸡，从其鸡蛋黄中提取的抗龋齿IgY抗体在牙 膏中的活性效价。 QB/T4363-2012 牙膏中蛋黄球蛋白（IgY）活性效价测定方法 1范围 本标准规定了牙膏中蛋黄球蛋白（IgY）活性效价的检测方法。 本标准适用于牙膏中添加蛋黄球蛋白（IgY）活性效价的测定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T601化学试剂标准滴定溶液的制备 GB/T603化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备(NEQISO6353-1:1982) GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法(NEQISO3696:1987) 3试验方法 本标准所用试剂和水，除特殊规定外，均为分析纯试剂和符合GB/T6682规定的水。 本标准中分析用标准滴定溶液、试验方法中所用制剂和制品，除特殊规定外，均按GB/T601和GB/T 603的规定制备。 3.1原理 利用抗原-抗体特异性免疫反应的原理，将抗原包被于酶标板上，加入特异性IgY抗体反应，再加标 有辣根过氧化酶的抗IgY的第二抗体，最终加入酶的底物，使酶催化底物显色，结果为阳性且稀释比最 大的为最终效价比。 3.2仪器和设备 a) 96孔酶标板： b)未 移液枪2把，量程分别为：10μL～100μL、100μL～1000μL； 微量进样器：精确度0.50μL，量程0μL～25μL； d) 分析天平：精确至0.001g; 电热恒温箱：精度土1℃； (+ 冰箱：精度土1℃； g) 酶标仪：型号MultiskanMK3或相当仪器。 3.3生化试剂 a）抗原：将菌浓度为2×10°cfu/mL的变形链球菌ATCC25175和亲缘链球菌ATCC0715灭活制得； b）酶标第二抗体：兔抗鸡IgG辣根过氧化酶（HRP）标记的二抗。 3.4试剂配制 3.4.1包被缓冲液：准确称取Na2CO,1.59g、NaHCO32.93g，加双蒸馏水定容至1000mL，得到0.05mol/L 的碳酸钠一碳酸氢钠缓冲液，4℃保存，有效期14天。 3.4.2稀释抗原：用包被缓冲液稀释抗原至合适浓度。变形链球菌ATCC25175和亲缘链球菌ATCC0715 的抗原用包被缓冲液稀释（即1份抗原加4份包被缓冲液）。 3.4.3洗涤液（PBST）：准确称取NaCI20.20g、KH2PO40.20g、Na2HPO4-12H2O2.83g，加Tween-20 5.0mL，加双蒸馏水定容至1000mL，4℃保存，有效期3个月。 3.4.4稀释液（PBS)：准确称取NaCl8.0g、KH2PO40.20g、Na2HPO4-12H202.90g、KCl0.20g，加 双蒸馏水定容至1000mL，4℃保存，有效期3个月。 1 QB/T43632012 3.4.5封闭液：1%牛血清白蛋白（0.1g牛血清白蛋白加10mlPBS）。 3.4.6酶标第二抗体的稀释：用PBS将酶标第二抗体按1:6000的浓度稀释，每次使用应做到现用现稀 释。 3.4.70.1mol/L/柠檬酸-磷酸盐缓冲液：准确称取C6HgOH207.30g、Na2HPO412H2023.90g，加双 蒸馏水定容至100mL，4℃保存，使用前将其恢复至室温后使用，有效期3个月。 3.4.8底物液：准确量取0.1mol/L/柠檬酸-磷酸盐缓冲液15.0mL，加0.0Q8g邻苯二胺以及5uL~10μL 30% H202c 注：底物液应配制在避光的棕色瓶内，且应现用现配，底物液为无色液体，若使用前底物液呈现黄色，则应重新配 制。 3.4.9终止液（2mol/L硫酸溶液）：准确称取98%浓硫酸20.0g，将浓硫酸缓慢加入到60mL双蒸馏水 中，最终定容至 100 mL。 3.5检验程序 3.5.1包被抗原：每个待测样品应做不少于2组平行样，并且在不同酶标板上进行测试时，每块酶标板 都要做空白以及阴性对照，各不少于2孔（阴性对照加PBS）。每孔加100L稀释的抗原（空白除外）， 置于4℃条件下！12h后方可使用（包被后抗原应在72h内用完）。 3.5.2封闭：酶标板每孔加封闭液200μL（空白除外），置于37℃条件下，40min后甩干，在每孔内 加满PBST，振摇1min，甩干，重复洗涤3次，最后在吸水纸上拍干。 3.5.3处理样品：称取x0.0g牙膏，加入70.0mLPBS，搅拌2h～3h，置于4℃条件下，12h后方可使 用。取上清液于β000f/min离心10min，吸取上清液（即为1:8样品液）待用（处理后的样品应置于4℃条 件下，在12h内用完）。 3.5.4加处理后的样品：先将包被后的抗原甩干，在每孔内加满PBST，振摇1min，甩干，重复洗涤 3次，最后在吸水纸上拍干。将上清液按梯度（1:8、1:16、1:32…1:1024、1:2048）对倍稀释，按 对倍稀释的梯度每孔各100μL加入酶标板中，置37℃条件下，2h后甩于，在每孔内加满PBST，振摇 1min，甩干，重复洗涤3次，最后在吸水纸上拍干。 3.5.5加入酶标第二抗体：每孔加入100μL酶标第二抗体（空白除外），置37-℃条件下，40min后甩 干，在每孔内加满PBST，振摇1min，甩干，重复洗涤3次，最后在吸水纸上拍干。 3.5.6加底物液：每孔加100μL底物液，避光显色，20min左右终止反应。 3.5.7终止反应／每孔加100uL终止液，10min内用酶标仪测定结果。 3.6结果判定 3.6.1效价判定以酶标仪显示的结果为准。效价等于测定样本孔吸收值（P）除以一组阴性样本测定孔 平均吸收值（N）。当P/N不小于2.1时，为阳性。阳性临界值为，X等于N乘以2.1，OD值不小于值为阳 性。取平均数据均为阳性且稀释比最大的那组为效价的最终判定结果，阴性表示没有效价。 3.6.2当发生下列任一情况时，应重新取样进行检测： a）空白载阴性对照显色不正常，影响测定结果的判断； b）酶标仪判定结果呈现无规律性变化； c）酶标仪的判定结果与目测显色结果存在明显差异