2 0 2 5 0 4 2 7 发 布 － － 2 0 2 5 0 8 0 1 － － 实 施 车 轮 虫 病 诊 断 方 法 5 0 中 华 人 民 共 和 国 水 产 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 1 5 0 C C S B 7 2 4 7 — 2 0 2 5 D i a g n o s t i c m e t h o d s f o r t r i c h o d i n i a s i s S C ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布SC/T７２４７—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部渔业渔政管理局提出. 本文件由全国水产标准化技术委员会水产养殖病害防治分技术委员会(SAC/TC１５６/SC１１)归口. 本文件起草单位:中国科学院水生生物研究所、全国水产技术推广总站、西北农林科技大学. 本文件主要起草人:李明、王桂堂、李文祥、张翔、梁艳、龚迎春、邹红、周伟钿、凌飞. ⅠSC/T７２４７—２０２５ 车轮虫病诊断方法 １　范围 本文件描述了鱼类车轮虫病诊断的试剂和材料、仪器设备、临床症状、样品,以及形态学鉴定、PCR检 测和综合判定的方法. 本文件适用于异齿车轮虫(Trichodinaheterodentata)、显著车轮虫(Trichodinanobilis)和网状车轮 虫(Trichodinareticulata)引起的鱼类车轮虫病的流行病学调查、诊断、检疫和监测. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 SC/T７１０３　水生动物产地检疫采样技术规范 ３　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件. ３􀆰１ 寄生虫　parasite 寄生于水生动物的动物,包括原虫、蠕虫和甲壳类等. [来源:SC/T７０１１􀆰１—２０２１,３􀆰２􀆰４􀆰２] ３􀆰２ 寄生虫病　parasitosis 寄生虫侵入水生动物而引起的疾病. [来源:SC/T７０１１􀆰１—２０２１,３􀆰２􀆰４􀆰３] ３􀆰３ 车轮虫　trichodinid 寄生于水生动物的一类具有附着盘结构的纤毛虫原生动物. ３􀆰４ 车轮虫病　trichodiniasis 由车轮虫侵入水生动物而引起的寄生虫病. ４　缩略语 下列缩略语适用于本文件. DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid) dNTPs:脱氧核糖核苷三磷酸混合物(deoxyＧribonucleosidetriphosphatemixture) EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid) PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction) TAE:TrisＧAcetateＧEDTA缓冲溶液 Taq:水生栖热菌(Thermusaquaticus) TE:Tris盐酸和EDTA缓冲溶液(EDTATris􀅰HCl) １SC/T７２４７—２０２５ Tris:三羟甲基氨基甲烷(trishydroxymethylaminomethane) ５　试剂和材料 ５􀆰１　水:符合GB/T６６８２中规定的一级水. ５􀆰２　无水乙醇:分析纯. ５􀆰３　异丙醇:分析纯. ５􀆰４　TaqDNA聚合酶:－２０℃保存,避免反复冻融. ５􀆰５　dNTPs(１０mmol/L):含dATP、dTTP、dGTP和dCTP各１０mmol/L. ５􀆰６　矿物油. ５􀆰７　１％硝酸银溶液:按附录A中A􀆰１的要求配制. ５􀆰８　裂解缓冲液:按A􀆰２的要求配制. ５􀆰９　５０×TAE电泳缓冲液:按A􀆰３的要求配制. ５􀆰１０　１×TAE电泳缓冲液:按A􀆰４的要求配制. ５􀆰１１　DNA抽提缓冲液１:按A􀆰５的要求配制. ５􀆰１２　DNA抽提缓冲液２:按A􀆰６的要求配制. ５􀆰１３　５mol/LNaCl溶液:按A􀆰７的要求配制. ５􀆰１４　TE缓冲液:按A􀆰８的要求配制. ５􀆰１５　１％琼脂糖凝胶:按A􀆰９的要求配制. ５􀆰１６　上游引物:５′ＧAACCTGGTTGATCCTGCCAGTＧ３′; 下游引物:５′ＧTGATCCTTCTGCAGGTTCACCTACＧ３′. ５􀆰１７　DNAmarker. ５􀆰１８　核酸染料. ５􀆰１９　阳性对照:分别含异齿车轮虫、显著车轮虫和网状车轮虫的DNA模板,－２０℃保存. ５􀆰２０　阴性对照:无车轮虫DNA模板,－２０℃保存. ５􀆰２１　吸管. ５􀆰２２　盖玻片. ５􀆰２３　载玻片. ５􀆰２４　培养皿. ５􀆰２５　离心管. ６　仪器设备 ６􀆰１　体式显微镜. ６􀆰２　普通光学显微镜. ６􀆰３　天平:感量０􀆰００１g. ６􀆰４　紫外灯. ６􀆰５　水浴锅或金属浴. ６􀆰６　高速冷冻离心机:４℃转速１２０００g以上. ６􀆰７　普通冰箱:具４℃冷藏室和－２０℃冷冻室. ６􀆰８　微量移液器. ６􀆰９　PCR扩增仪. ６􀆰１０　水平电泳系统. ２SC/T７２４７—２０２５ ６􀆰１１　凝胶成像系统. ７　临床症状 少量感染车轮虫的鱼体症状不明显.大量感染时,病鱼通常消瘦、体色暗黑,食欲下降,平时游动迟 缓,但受惊扰时就狂躁不安,有的病鱼集群沿塘边狂游呈“跑马”症状(环游不止);病鱼鳃丝受损、泛白,鳃 部及体表黏液增多,部分鳍条末端缺失,有时体表可见一层白膜. ８　样品 ８􀆰１　采样对象 优先采集具有典型临床症状的鱼. ８􀆰２　采样数量 每一采样批次取１０尾~２０尾.采样数量应符合SC/T７１０３中的规定. ８􀆰３　采样部位 鱼苗取整条鱼;鱼种或成鱼取鳃丝、鳍条,刮取体表黏液. ８􀆰４　样品运输 取样应加贴标签,标签上清楚标明样品编号、采样时间、采样地点.样品运输应符合SC/T７１０３中的 规定. ８􀆰５　样品固定与保存 在体视显微镜下(放大４０倍)用吸管吸取虫体,部分样品制作水浸片,普通光学显微镜检查.部分样 品置于培养皿中,用水清洗后移至洁净的载玻片上,尽量吸去水分并在空气中干燥,制成干片,用于硝酸银 染色和后续形态学参数测量.用于PCR检测的虫体样品用水清洗干净后可直接加入无水乙醇固定,４℃ 保存备用. ９　形态学鉴定 ９􀆰１　水浸片观察 吸取虫体置于载玻片上,轻轻盖上盖玻片,置于普通光学显微镜下进行活体观察. ９􀆰２　硝酸银染色与形态学参数测量 用１％硝酸银溶液(５􀆰７)覆盖虫体干片样品,置于黑暗处染色１min.用水清洗后,自然晾干;置于紫 外灯下照射１０s~２０s显影.将硝酸银染色的标本置于显微镜下,测量虫体直径、附着盘直径、齿体数、口 围绕度;同时观察齿钩、齿锥、齿棘特征以及附着盘中心有无颗粒等. ９􀆰３　结果判定 ９􀆰３􀆰１　车轮虫属的形态学鉴定 车轮虫属(Trichodina)的口区和反口区均为圆形,如车轮状.侧面形态特征见附录B中的图B􀆰１,形 似帽状,口面隆出,反口面平截.细胞核有大核和小核之分,大核马蹄形,小核球形、椭圆或卵形,通常位于 大核臂的一端外侧.反口面形态特征见图B􀆰２,最显著的结构是齿环和辐线环.齿环是分属的重要依据, 由数量不等的齿体组成.齿体具有发达空锥形的锥部,从内向外扩展成镰刀状或新月形的齿钩,以及向中 心的针状或棒状的齿棘. 如果虫体的形态学特征与上述描述相符,则判定为车轮虫. ９􀆰３􀆰２　三种典型车轮虫的形态学鉴定 ９􀆰３􀆰２􀆰１　异齿车轮虫的形态学鉴定 异齿车轮虫的反口面形态特征见图B􀆰３.活体状态下呈毡帽状,干银染色标本显示其虫体直径 ２７􀆰０μm~１２２􀆰０μm;附着盘直径２５􀆰０μm~８９􀆰２μm;齿环直径１６􀆰０μm~５５􀆰９μm;附着盘中心无颗粒, 表现为均匀的深褐色;齿体数１６个~３１个,齿钩呈弯月状,前后曲度较大,基部有一明显缺刻;齿锥棘发 达;齿棘呈粗针状,棘突明显.每个齿体占的辐线数为５条~１５条;口围绕度２９２°~４３０°. ３SC/T７２４７—２０２５ 如虫体的形态学特征与上述描述相符,则判定为疑似异齿车轮虫. ９􀆰３􀆰２􀆰２　显著车轮虫的形态学鉴定 显著车轮虫的反口面形态特征见图B􀆰４.活体侧面观扁平呈碟状,虫体高与直径之比约为１∶４.干 银染色标本显示其虫体直径５２􀆰０μm~１０８􀆰２μm;附着盘直径４６􀆰０μm~９３􀆰０μm;齿环直径２６􀆰０μm~ ５８􀆰０μm;齿体数２１个~２９个,齿钩呈扇状,钩柄特别长且细小;齿锥比一般种类细小;齿棘呈细长的针 状,长度大于齿钩;每个齿体占的辐线数为１０条~１４条;口围绕度３９０°~４００°. 如果虫体的形态学特征与上述描述相符,则判定为疑似显著车轮虫. ９􀆰３􀆰２􀆰３　网状车轮虫的形态学鉴定 网状车轮虫的反口面形态特征见图B􀆰５.活体侧面观身体扁平,其两侧一般向内微凹入,干银染色标 本显示其虫体直径４０􀆰０μm~９５􀆰０μm;附着盘直径３１􀆰０μm~６６􀆰０μm;齿环直径１９􀆰７μm~４１􀆰０μm; 齿体数１９个~３４个,每个齿体占的辐线数为８条~１２条;齿钩呈长方形,刀尖较钝圆,基部有浅的缺刻; 齿锥发达;齿棘短棒状,较直,末端钝圆较弯曲;附着盘中央有１２个~１６个形状、大小不一的颗粒物.口 围绕度３７０°~４１０°. 如果虫体的形态学特