ICS 11.020 CCS C 62 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 3558—2025 代替 SN/T 3558—2013 2025 ‑07‑25发布 2026 ‑02‑01实施国境口岸马尔堡病毒检验 Test methods for Marburg virus at frontier ports 中华人民共和国海关总署 　　发　 布SN/T 3558—2025 前 言 本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则　第 1部分：标准化文件的结构和起草规则 》的规定 起草。 本文件代替 SN/T 3558 —2013《马尔堡病毒 RT‑PCR 和实时荧光 RT‑PCR 检测方法 》 ，与SN/T 3558 —2013相比，除结构调整和编辑性改动外 ，主要技术变化如下 ： ——更改了马尔堡病毒实验室检测的生物安全要求 （见第 5章，2013年版的第 5章） ； ——更改了马尔堡病毒荧光 RT‑PCR 检测方法 GP基因片段引物探针 （见附录 B中表 B.1，2013年 版的 9.2中表 1） ； ——更改了马尔堡病毒 RT‑PCR 和荧光 RT‑PCR 检测方法 （见附录 A中表 A.1、附录 B中B.4.2， 2013年版的 8.2，9.4.1） ； ——更改了荧光 RT‑PCR 检测方法结果判定与报告 （见附录 B中B.5，2013年版的 9.5） 。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口 。 本文件起草单位 ：中华人民共和国广州海关技术中心 、中国科学院武汉病毒研究所 。 本文件主要起草人 ：洪烨、袁帅、蔡扬尧、师永霞、戴俊、郑夔、黄吉城、邓燕凤、袁志明、黄弋、相大鹏。 本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为 ： ——2013年首次发布 SN/T 3558 —2013； ——本次为第一次修订 。 ⅠSN/T 3558—2025 引 言 马尔堡出血热是由马尔堡病毒引起的以急性发热伴有严重出血为主要临床表现的传染性疾病 ，经密 切接触传播 ，传染性强 ，病死率高 。 现有标准如 SN/T 1231 —2010《国境口岸埃博拉出血热和马尔堡出血热疫情监测与控制规程 》仅提 供了国境口岸马尔堡出血热的监测对象 、疫情监测 、疫情控制 、疫情报告和个人防护原则 ；SN/T 1311 — 2003《马尔堡病检测方法 》仅提供了针对马尔堡病抗体水平的检测方法 ，未提供分子生物学检测方法 。 ⅡSN/T 3558—2025 国境口岸马尔堡病毒检验 1 范围 本文件规定了国境口岸马尔堡病毒分子生物学检验的检验对象 ，生物安全和 PCR防污染要求，样本 采集、运送与保存 ，检验方法与 结果报告 ，描述了相应的检验方法 。 本文件适用于对国境口岸可疑病人进行马尔堡病毒检验 。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件 ；不注日期的引用文件 ，其最新版本 （包括所有的修改单 ）适用于本 文件。 GB 19489　实验室生物安全通用要求 WS/T 230　实时荧光聚合酶链反应临床实验室应用指南 病原微生物实验室生物安全管理条例 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 。 3.1 马尔堡病毒 Marburg virus 属丝状病毒科 ，病毒基因组为单股负链 RNA，长约 19 kb，编码 7种病毒蛋白 ，包括 N蛋白（NP） 、病 毒蛋白 35（VP35） 、病毒蛋白 30（VP30） 、病毒蛋白 24（VP24） 、糖蛋白 4（gp4） 、RNA依赖的 RNA聚合酶 主要成分糖蛋白 7（gp7）和次要成分病毒蛋白 40（VP40） 。 3.2 马尔堡病毒病 Marburg virus disease 由马尔堡病毒 （Marburg virus ）引起的、以急性发热伴有严重出血为主要临床表现的传染性疾病 ，经 密切接触传播 ，传染性强 ，病死率高 。 注： 由于马尔堡病毒来自于非洲绿猴并主要在非洲流行 ，又被称为青猴病和非洲出血热 。 3.3 逆转录 -聚合酶链反应 reverse transcription polymerase chain reaction 聚合酶链反应的一种广泛应用的变形 。在逆转录 -聚合酶链反应中 ，由一条 RNA单链转录为互补 DNA（cDNA）称作“逆转录” ，由依赖 RNA的DNA聚合酶（逆转录酶 ）来完成。随后，DNA的另一条链 通过脱氧核苷酸引物和依赖 DNA的DNA聚合酶完成 ，随每个循环倍增 ，即通常的 PCR。原先的 RNA 模板被 RNA酶降解，留下互补 DNA。 3.4 实时荧光逆转录 -聚合酶链反应 real‑time reverse transcription polymerase chain reaction 逆转录 -聚合酶链反应扩增过程中 ，通过引入荧光化学物质 ，每经过一个循环 ，收集一个荧光强度信 号，通过对逆转录 -聚合酶链反应扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板 1SN/T 3558—2025 定量及定性的分析 。 4 检验对象 4.1 马尔堡病毒病留观病例 、疑似病例和确诊病例 。 4.2 其他申请马尔堡病毒检验的人员样本 。 5 生物安全和 PCR防污染要求 实验室生物安全应符合 GB 19489和《病原微生物实验室生物安全管理条例 》的规定。PCR防污染 措施按 WS/T 230的规定执行 。 马尔堡病毒相关的未经培养的感染性材料的操作应在生物安全三级 （BSL‑ 3）实验室内进行 。 马尔堡病毒相关的灭活材料的操作在生物安全二级 （BSL‑ 2）实验室内进行 。 马尔堡病毒感染材料的运输包装分类为 A类，UN编号为 UN2814，采用三层包装系统 。 6 样本采集 、运送与保存 6.1 样本采集 静脉采集疑似病人抗凝全血 3 mL。采血后立即颠倒混匀 ，使抗凝剂与血液充分混合 。采血管上应 有个人信息的唯一性标识 。置4 ℃冰箱冷藏 ，并尽快低温运送到实验室待进一步检测 。 6.2 样本的运送与保存 样本于 2 ℃~ 8 ℃下运送至实验室检测 。上述样本如 72 h内不能送到实验室 ，应置于 -70 ℃保存。 样本运输应按照相关生物安全规定 ，采取三层包装系统 A类包装，低温冷藏运输 ，避免反复冻融 。 7 检验方法与结果报告 马尔堡病毒 RT‑PCR 检验及结果报告按附录 A进行；实时荧光 RT‑PCR 检验及结果报告按附录 B 进行。其他通过性能验证的商品化试剂盒也可使用 ，按照试剂盒说明书进行 。 2SN/T 3558—2025 附 录 A （规范性 ） 马尔堡病毒的 RT‑PCR 检测 A.1 主要设备 主要设备如下 ： ——PCR扩增仪； ——千分之一天平 ； ——二级生物安全柜 ； ——高压灭菌锅 ； ——低温高速离心机 ：最大离心力 20 000g； ——电泳仪； ——凝胶成像分析系统 ； ——漩涡振荡器 ； ——移液器：2.5 μL、10 μL、20 μL、100 μL、200 μL和1 mL。 A.2 主要试剂 主要试剂如下 ： ——核酸提取试剂 ； ——RT‑PCR 基础试剂 ； ——检测引物 （见表 A.1） 。 表A.1　马尔堡病毒 RT‑PCR 检测引物 引物名称 MBGV‑FP MBGV‑RP 注：预期扩增片段为 381 bp。简并碱基中 M为A或C；Y为C或T。序列（5′‑3′） AAATGTCCAAACACTYGCAGAAGC GCACAATCMGGTGGGTTATTTCG A.3 核酸提取 参照核酸提取试剂说明书进行 。 A.4 RT‑PCR 反应 A.4.1 反应体系 反应体系为 50 μL，按照表 A.2进行配制 。 3SN/T 3558—2025 表A.2　RT‑PCR 反应体系 成分 2×One Step Mix One step Enzyme Mix MBGV‑LuP MBGV‑LdP RNA/模板 DEPC水加样量（体积 /浓度） 25 μL 2.5 μL 0.4 μmol/L 0.4 μmol/L 5 μL 补充至总体积 50 μL A.4.2 扩增程序 50 ℃逆转录 30 min，94 ℃预变性 3 min；94 ℃变性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃ 1 min ，30个循环；4 ℃保 存。反应参数可根据基因扩增仪型号的不同进行适当的调整 。 A.4.3 阳性对照 、阴性对照和空白对照设置 检测过程中分别设阳性对照 、阴性对照和空白对照 。阳性对照为根据马尔堡病毒相应扩增片段经人 工合成并体外转录的模板 RNA（序列参见附录 C） ；阴性对照为正常人标本 ；空白对照为 DEPC水。 A.5 凝胶电泳 扩增结束后 ，在5 μL扩增产物中加入 1 μL 6×DNA上样缓冲液 ，用含 10 000×DMSO 核酸凝胶染料 去染 1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物 ，用凝胶成像系统照相记录结果 。 A.6 结果判定 A.6.1 质量控制 反应结果应同时符合以下 两个条件： ——阴性对照 、空白对照无扩增条带 ； ——阳性对照出现预期 380 bp大小的扩增条带 。 A.6.2 结果判定与报告 当同时进行的阳性对照 、阴性对照 、空白对照试验结果正常时 ，本方法检验结果判定和报告如下 ： ——未出现预期 380 bp大小的扩增条带 ，报告“未检出马尔堡病毒特异性基因 （R