以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5763 —2025 暗色刺参鉴定方法 荧光 PCR 法 Identification for Isostichopus fuscus —Real-time PCR method 2025 -07-25发布 2026 -02-01 实施ICS 65.150 CCS B 50 中华人民共和国海关总署 发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准 SN/T 5763—2025I前 言 本文件按照 GB/T 1.1— 2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规 定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国杭州海关。本文件主要起草人：吴姗、方云、何永强、张晓峰、虞惠贞、张明哲、尹文秀、张荃、沈旭芳、 应正平、李炎锟。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1 SN/T 5763—2025暗色刺参鉴定方法 荧光 PCR 法 1　范围 本文件描述了暗色刺参（ Isostichopus fuscus ）的实时荧光 PCR 鉴定方法。 本文件适用于暗色刺参及以暗色刺参为原料的食品、保健品中暗色刺参成分的定性鉴定。 2　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3　术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4　缩略语 下列缩略语用于本文件。bp：碱基对（base pair） 。COI 基因：高等生物细胞中线粒体的细胞色素 C 氧化酶亚基 I（cytochrome C oxidase subunit I gene） 。CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammonium bromide） 。DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid） 。dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate） 。FAM：6- 羧基荧光素（6-carboxyfluorescein） 。Na 2-EDTA：二胺四乙酸二钠（Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt） 。 OD：光密度值（optical density） 。 PCR: 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction） 。ROX：羧基 -X- 罗丹明（carboxy-X-rhoa mine） 。 Taq酶：从水生热栖菌中分离出的具有热稳定性的 DNA 聚合酶（thermus aquaticus） 。 TE：Tris-HCl、EDTA 缓冲液。 Tris：三（羟甲基）氨基甲烷［tris (hydroxymethyl) aminomethane］ 。 5　方法原理 用暗色刺参物种特异性引物及探针对暗色刺参 DNA 进行实时荧光 PCR 扩增，根据扩增曲线与 Ct 值进行判定，实现对暗色刺参物种的鉴定。 6　仪器设备6.1 实时荧光 PCR 仪。 6.2 恒温水浴锅或干式恒温器。 6.3 离心机：最大离心力不小于 16 000 g。以正式出版文本为准2 SN/T 5763—20256.4 微量移液器：2.5 μL、10 μL、20 μL、100 μL、200 μL、1 000 μL。 6.5 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 6.6 pH 计。 6.7 涡旋振荡仪。 6.8 天平：感量 0.01 g。 6.9 高压灭菌器。 7　试剂和材料 7.1　试剂级别 除另有规定外，所有试剂为分析纯试剂。试验用水应符合 GB/T 6682 中二级水的要求。 7.2　化学试剂 氢氧化钠溶液（10 mol/L） ，Na2-EDTA 溶液（0.5 mol/L，pH 8.0） ，Tris-HCl 溶液（1 mol/L，pH 8.0） ， CTAB 裂 解 液（2.0%） ，CTAB 沉 淀 液（0.5%） ， 蛋 白 酶 K 溶 液（20 mg/mL） ，NaCl 溶 液（1.2 mol/L） ， RNase A 酶，三氯甲烷，异丙醇，70% 的乙醇，TE 缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0；1 mmol/L Na2- EDTA 缓冲液，pH 8.0） 。试剂配制方法按照附录 A 执行。 7.3　分子生物学试剂 实时荧光 PCR 反应混合液，试剂配制方法按照 A.9 执行，也可使用商品化的预混液。 7.4　引物和探针 上游引物 F ：5’CAGCTGGAGGAGGAGACC3’ 下游引物 R ：5’GGGCTCAGACTAGGAATCC3’ 探针 P ：5’FAM-TCTTCCTGGGTTTGGAATGA-ECLIPSE3’ 扩增的目的基因为线粒体的 COI 基因，扩增片段长度 204 bp，扩增的靶标序列见附录 B。 7.5　质控品 7.5.1 阳性质控品：含暗色刺参成分的样品或含有 PCR 扩增目的片段的阳性质粒。 7.5.2 阴性质控品：不含暗色刺参成分或 DNA 的样品。 7.5.3 空白质控品：无菌双蒸水。　 8　实验步骤8.1　制样8.1.1 干海参：先用水泡发软化，取约 5 g 样品进行匀浆。 8.1.2 即食海参：取约 5 g 样品进行匀浆。 8.1.3 粉末及液体样品：可直接进行 DNA 提取。 8.2 样品 DNA 提取 8.2.1 DNA 提取方法 宜采用商品化的动物组织 DNA 提取试剂盒进行 DNA 提取，具体提取步骤参照试剂盒说明书。 也可采取 8.2.2 的CTAB 法进行提取。以正式出版文本为准3 SN/T 5763—20258.2.2 CTAB 法提取 DNA 8.2.2.1 称取约 200 mg 已经制备好的样品于 2 mL 离心管中，加入 1.0 mL 2.0% CTAB 裂解液和 10 μL 蛋白酶 K，振荡混匀， 65 ℃恒温 30 min ，期间每隔 10 min 振荡混匀。 8.2.2.2 15 000 g离心 10 min ，取上清液至一新的离心管，加入 300 μL 三氯甲烷，涡旋振荡充分混 匀， 15 000 g离心 10 min 。 8.2.2.3 取上清液至新的离心管中，加入 2倍体积的 0.5% CTAB 沉淀液，颠倒混匀，室温静置 1 h， 15 000 g离心 5 min ，弃上清液。 8.2.2.4 加入 400 μL 1.2 mol/L NaCl 溶液，室温放置 10 min ，使 DNA 全部溶解，加入 10 μL RNase A酶， 37 ℃恒温 20 min 。 8.2.2.5 加入 400 μL 三氯甲烷，涡旋振荡混匀， 15 000 g离心 10 min ，取上清液至新的离心管，加 入0.7倍体积的异丙醇，颠倒混匀，室温静置 10 min ，15 000 g离心 10 min 。 8.2.2.6 弃上清液，加入 500 μL 70% 乙醇，颠倒混匀， 15 000 g离心 2 min ，弃上清液。重复一次。 8.2.2.7 短暂离心，将残余上清液吸尽，将 DNA 晾干。加入 20 μL ～100 μL TE 溶液（酌情加入， 使DNA 的浓度满足后续检测的需求） ，使 DNA 完全溶解。 DNA 样品保存于 - 20 ℃备用。 8.3 DNA 浓度和纯度的测定 样品 DNA 使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测定 260 nm 和 280 nm 处的吸光值 A260 和 A280。DNA 的浓度按公式（1）进行计算： c = A × N × 50 ………………………………………………… （1） 式中： c —— DNA 浓度，单位为纳克每微升（ng/ μL ）； A —— 260 nm 处的吸光值； N ——核酸稀释倍数。 当 DNA 浓度在 5 ng/ μL~60 ng/ μL 之间，A260/A280比值在 1.6 ～ 2.1 之间时，DNA 模板适宜于 PCR 扩增。 8.4 实时荧光 PCR 检测 8.4.1 实时荧光 PCR 反应体系 反应体系体积为 2 0 μL ，其中含 ：实时荧光 P C R 反应混合液 1 0 μL ，上游引物和下游引物 （10 μmol/L）各 0.4 μL，探针（10 μmol/L）0. 4 μL，模板 DNA（5 ng/ μL~60 ng/ μL）2 μL，双蒸水补足 至 20 μL。 8.4.2 实时荧光 PCR 反应参数 实时荧光 PCR 反应条件一般为：95 ℃ 2 min ；95 ℃ 15 s，60 ℃ 40 s ，40 个循环。根据所用仪器 型号及试剂不同，按使用说明进行适当调整。 8.5 质量控制 8.5.1 空白对照：无 FAM 荧光扩增曲线，无 Ct值。 8.5.2 阴性对照：无 FAM 荧光扩增曲线，无 Ct值。 8.5.3 阳性对照： FAM 荧光通道出现典型的扩增曲线， Ct值≤ 30.0。 以上条件有一条不满足时，试验视为无效。 9 结果判定及表述 9.1 双孔复检的 Ct 值皆＞ 37.0 或无 Ct 值，可判为阴性，表明样品中不含有