以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5769 —2025 十二种虾病病原恒温扩增 微流控芯片检测方法 Microfluidic chip detection of twelve shrimp pathogens — Isothermal amplification method 2025 -07-25发布 2026 -02-01 实施ICS 11.220 CCS B 41 中华人民共和国海关总署 发 布 以正式出版文本为准以正式出版文本为准 SN/T 5769—2025I前 言 本文件按照 GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国深圳海关、深圳市检验检疫科学研究院、中华人民共和国沈 阳海关技术中心、中华人民共和国烟台海关、复旦大学、宁波爱基因科技有限公司。 本文件主要起草人：秦智锋、吴江、孙洁、温智清、耿庆华、廖立珊、王津津、林彦星、陈兵、 阮周曦、尹伟力、刘萌、方雪恩、孔继烈。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1 SN/T 5769—2025十二种虾病病原恒温扩增微流控芯片检测方法 1 范围 本文件规定了虾中肝肠胞虫（ Enterocytozoon hepatopenaei , EHP） 、急性肝胰腺坏死弧菌（ Vibrio parahaemolyticus causing AHPND, VPAHPND ） 、传染性皮下及造血组织坏死病毒（Infectioushypodermal and haematopoietic necrosis virus, IHHNV） 、白斑综合症病毒（White spot syndrome virus, WSSV） 、十足目虹 彩病毒 1（Decapod iridescent virus 1, DIV1） 、哈维氏弧菌（ Vibrio harveyi, VH） 、黄头病毒 1（Yellow head virus 1, YHV1） 、 桃 拉 病 毒（Taura syudrome virus, TSV） 、 肝 胰 腺 细 小 病 毒（Hepatopancereatic parvovirus, HPV） 、偷死野田村病毒（Covert mortality nodavirus, CMNV）和对虾传染性肌肉坏死病毒 （Infectious myonecrosis virus, IMNV） 、罗氏沼虾诺达病毒（ Macrobrachium rosenbergii nodavirus, MrNV） 12 种虾病病原的恒温扩增微流控芯片核酸检测方法。 本文件适用于上述 12 种虾病病原的检测和诊断。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于 本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法GB/T 18088 出入境动物检疫采样GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。Bst ：嗜热脂肪芽孢杆菌（ bacillus stearothermophilus ） DNA ：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid）DEPC ：焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate）EDTA ：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid）FEN ：结构特异性核酸内切酶（flap structure-specific endonuclease）RNA ：核糖核酸（ribonucleic acid）SDS ：十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）Tris-HCl ：三羟甲基氨基甲烷 - 盐酸［tris（hydroxymethyl）aminomethane-hydrochloric acid］以正式出版文本为准2 SN/T 5769—2025Tt 值：时间阈值（time threshold） 5 技术原理 针对 12 种待检虾病原，从 GenBank 下载核酸序列，通过序列比对找到每种病原的保守序列，针 对保守区设计合成引物。 使用微流控芯片技术 ，将E H P 、 VPAHPND 、IHHNV、WSSV、DIV1、VH、YHV1、TSV、HPV、 CMNV、IMNV 和 MrNV 引物分别预先固定在微米尺度的微流控芯片相应位置后，对微流控芯片进行 封装，将待测样本与反应液（包含 SYBR Green 荧光染料）混合后，加到封装好的微流控芯片中，之后放入到带有离心功能、恒温功能及实时荧光检测一体化的微流控芯片检测仪中，利用离心力驱动样品进入微流控芯片反应孔，进行恒温扩增。若样本中含有目的片段，则能够实现恒温扩增，扩增产物将与荧光物质进行结合，通过荧光检测仪实时捕获荧光信号，直观反应扩增产物的产生，根据实时荧光信号的出现时间、强度和位置，判断样本中是否含有相应的病原。 6 仪器和设备 6.1 微流控芯片检测仪。 6.2 微量点样仪。 6.3 纯水仪。 6.4 低温冷冻离心机。 6.5 恒温干燥箱。 6.6 高压锅。 6.7 漩涡振荡仪。 6.8 低温冰箱。 6.9 微量移液器（0.5 µL、2 µL、100 µL、1000 µL ）。 7 试剂和材料 7.1 微流控芯片试剂组分和存放条件见附录 A。除非另有说明，在检测中所用的试剂均为分析纯， 实验室用水应符合 GB/T 6682 的要求。所有试剂均用无核酸酶污染的容器分装。 7.2 阴性对照、阳性对照和内参对照： ——阴性对照：从未感染目标病原的虾组织提取的核酸；——阳性对照：从感染目标病原的虾组织提取的核酸或人工合成的含有目标核酸序列的 DNA 片段；——内参对照：包括扩增内参基因片段的引物和人工合成的内参质粒（非虾病原的基因片段） ，其中引物固定于微流控芯片反应孔中，内参质粒存在于反应液中。7.3 反 应 液：20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.8） ，10 mmol/L KCl，10 mmol/L （NH4）2SO4，8 mmol/L MgSO4， 0.1% Tween-20，1.4 mmol/L dNTPs，8000 U/mL Bst DNA 聚 合 酶，0.5 mg/mL FEN，50 µmol/L SYBR Green 荧光染料，内参质粒（400 copies/ µL ）。 7.4 核酸提取试剂：可同时提取 DNA 和 RNA，包含蛋白酶 （20 mg/mL） 、磁珠 （50 mg/mL） 、裂解液、 异丙醇、洗液一、洗液二、洗液三和洗脱液，试剂配制方法见附录 B。也可使用其他等效核酸提取试 剂或者将 DNA 和 RNA 分别提取的试剂。 7.5 高温反转录酶：5000 U/mL。 7.6 RNase 抑制剂：40 U/ µL。 7.7 引物：12 种虾病病原检测引物序列见附录 A，12 种虾病病原基因参考序列见附录 C。以正式出版文本为准3 SN/T 5769—20257.8 微流控芯片：5 µL/ 反应池，8×4 离心微流控芯片。可根据实际需求选择其他类型等效的商品化 微流控芯片。 7.9 耗材：封口膜、无 RNase 吸头、无 RNase 离心管。 8 试验方法 8.1 样品采集和处理 8.1.1 一般要求 样品的采集、保存和运输应符合 GB/T 18088 的规定。样品的处理应符合 GB 19489 的规定。 8.1.2 样品采集 8.1.2.1 成虾：取鳃或上皮、肝胰腺、肠、胃、游泳足或步足等病灶部位。 8.1.2.2 幼虾、仔虾、幼体或受精卵：取整体。 8.1.2.3 优先选择濒死虾或有临床症状的虾。 8.1.3 样品前处理 同一批样品，应多点采集合并后，作为一份样品进行均质，核酸提取。采样过程应快速完成，将 采取的样品放入无菌均质袋或者已灭菌 1.5 mL 的离心管中，均质成糜状，加入 400 μL~800 μL 无菌的 生理盐水，充分混匀，备用。 8.1.4 样品存放与运输 采集或处理的样品在 2 ℃ ~8 ℃条件下保存应不超过 24 h；若需长期保存，应放置于 -70 ℃保存， 并且避免反复冻融（冻融不超过 3 次） 。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，在 6 h~ 8 h 之内运输到实验室。8.2 核酸提取 8.2.1 核酸提取准备 8.2.1.1 本文件以常规核酸提取试剂（可同时提取 DNA 和 RNA）为例说明核酸提取步骤。实验前， 将各试剂于室温下溶解，充分混匀并短暂离心后使用。 8.2.1.2 裂解液置于 56 ℃温浴至沉淀完全溶解后使用。 8.2.1.3 将蛋白酶混合物 (20 mg/mL) 充分混匀后，按照每管 20 µL 分装至各离心管中。 8.2.2 核酸提取步骤 8.2.2.1 向上述已加蛋白酶的离心管中加入 200 µL 待提取样本，混匀；再加入 400 µL 裂解液，漩涡 振荡 10 s，56 ℃孵育 10 min