以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5772—2025 熊蜂孢子虫鉴定技术规范 Identification protocol for Apicystis bombi 2025 -07-25发布 2026 -02-01 实施ICS 11.220 CCS B 41 中华人民共和国海关总署 发 布 以正式出版文本为准 中华人民共和国出入境检验检疫 开本  880×1230  1/16   印张  1   字数  31  千字 2025 年 8 月第一版   2025 年 8 月第一次印刷 印数 1—500 书号：155175·1217   定价  16.00 元熊蜂孢子虫鉴定技术规范行   业   标   准 SN/T 5772—2025 * * *北京市朝阳区东四环南路甲1号（100023） 编辑部：（010）65194242-7530 北京中科印刷有限公司印刷中国海关出版社有限公司出版发行 以正式出版文本为准 SN/T 5772—2025 I前 言 本文件按照GB/T   1.1—2020《标准化工作导则   第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规 定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国福州海关、中华人民共和国长春海关、中华人民共和国潍坊 海关、中华人民共和国杭州海关。 本文件主要起草人：张体银、宋战昀、黄嫦娇、郑腾、郑晖、田国宁、何永强、李宋钰、王武 军、张志灯、于师宇。 以正式出版文本为准 以正式出版文本为准1 SN/T 5772—2025 熊蜂孢子虫鉴定技术规范 1 范围 本文件规定了熊蜂孢子虫的形态学、PCR 和荧光 PCR 检测方法。 本文件适用于熊蜂孢子虫的实验室鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件。 GB/T   6682   分析实验室用水规格和试验方法。 GB   19489   实验室   生物安全通用要求。 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件：Ct ：Cycle   threshold，循环阈值。 CTAB ：Cetyltrimethylammonium   bromide，十六烷基三甲基溴化铵。 DNA ：Deoxyribonucleic   acid，脱氧核糖核酸。 dNTP：Deoxynucleoside   triphosphate，三磷酸脱氧核苷酸。 EB ：Ethidium   bromide，溴化乙锭。 ITS ：Internal   transcribed   space，内转录间隔区。 PBS ：Phosphate   buffered   saline，磷酸盐缓冲溶液。 PCR ：Polymerase   chain   reaction，聚合酶链式反应。 SDS ：Sodium   dodecyl   sulfate，十二烷基硫酸钠。 TBE ：Trihydroxymethyl   aminomethane-boric   acid-ethylene   diamine   tetraacetic   acid，三羟甲基氨基甲 烷 - 硼酸 - 乙二胺四乙酸。 TE 缓冲液：Tris-EDTA   buffer，Tris-EDTA 缓冲液。 5 设备 5.1   高压灭菌锅。 5.2   样品制备仪。 以正式出版文本为准2 SN/T 5772—2025 5.3 生物显微镜：100× ～ 400×（见图 A.1） 。 5.4   电子天平（感量 0.01   g） 。 5.5   高速冷冻离心机。 5.6   PCR 仪。 5.7   荧光 PCR 仪。 5.8   微量移液器（0.5   μL ～ 10   μL,   2   μL ～ 20   μL,   20   μL ～ 200   μL,   100   μL ～ 1   000   μL ）。 5.9   生物安全柜。 5.10   电泳仪。 5.11   凝胶成像系统。 5.12   冰箱（2   ℃～ 8   ℃和 -20   ℃） 。 6 试剂 6.1   水：符合 GB/T   6682 一级水的规格。 6.2   0.01   mol/L（pH7.2）PBS，配制方法见附录 B 中的 B.1。 6.3   TE 缓冲液，配制方法见附录 B 中的 B.2。 6.4   10%   SDS 溶液，配制方法见附录 B 中的 B.3。 6.5   蛋白酶 K。 6.6   5   mol/L 的 NaCl 溶液，配制方法见附录 B 中的 B.4。 6.7   CTAB/NaCl 溶液，配制方法见附录 B 中的 B.5。 6.8   三氯甲烷 / 异戊醇混合液，配制方法见附录 B 中的 B.6。 6.9   酚 / 三氯甲烷 / 异戊醇混合液，配制方法见附录 B 中的 B.7。 6.10   10×PCR   缓冲液。 6.11   dNTPs（含dCTP、dGTP、dATP、dTTP） 。 6.12   Taq   DNA 聚合酶。 6.13   琼脂糖。 6.14   0.5×TBE 缓冲液，配制方法见附录 B 中的 B.8。 6.15   核酸凝胶染料。 6.16   DNA 相对分子质量标准品。 6.17   DNA 纯化回收试剂盒。 7 生物安全措施 实验室检测条件应符合 GB   19489 要求。 8 采样 8.1 采样数量 采样数量如表 1 所示。 以正式出版文本为准3 SN/T 5772—2025 表 1 采样数量表 蜂群数量（群） 采样数量（份） 蜂群数量（群） 采样数量（份） 蜂群数量（群） 采样数量（份） 1 1 13 13 51~57 25 2 2 14~16 14 58~67 26 3 3 17~18 15 68~80 27 4 4 19~20 16 81~99 28 5 5 21~22 17 100~126 29 6 6 23~24 18 127~170 30 7 7 25~27 19 171~256 31 8 8 28~30 20 257~495 32 9 9 31~34 21 496~4659 33 10 10 35~38 22 ≥ 4660 34 11 11 39~43 23 12 12 44~50 24 注：采样数量计算公式见附录 C，也可参照其他采样规定执行。 8.2 采样方法 从每个选定蜂群中采集活力较弱的熊蜂30只作为一份，放入烧杯内盖好，记录群号。检验前先 将活蜂用乙醚处死或置于冰箱冷冻室内冷冻 10   min。 9 形态学检测 9.1 样品处理 从每份样品中随机选取10只熊蜂，解剖取其脂肪体组织放入灭菌过的研钵中，加5   mL   0.01   mol/L   PBS 研磨成混悬液。 9.2 镜检 将处理好的组织悬液，取一滴滴至载玻片上，覆盖盖玻片，每组样品制作3张玻片，置生物学 显微镜（400×）下观察，每张玻片观察15个～20个视野。熊蜂孢子虫的孢子呈香肠状，大小为   （11.1   μm ～ 14.4   μm）×（3.6   μm ～ 5.4   μm） （参见附录 A） 。 9.3 结果判定 根据镜检观察到的形态特征的符合程度可初步判定为可疑。 10 PCR 检测 10.1 引物 10.1.1   上游引物 Api-F1: 5’- AGC GAT GGA TGT CTT GGG -3’ 。 以正式出版文本为准4 SN/T 5772—2025 10.1.2  下游引物 Api-R1: 5’- TTC AGC GGG TAA CCT TGT -3’ 。 10.1.3   根据熊蜂孢子虫 ITS基因序列设计，扩增长度约为 316 bp，用 双蒸 水溶解至 10 μmol/L 后， 保存于 -20 ℃冰箱 备用。 10.2 设立对照 10.2.1   使用经过鉴定含熊蜂孢子虫的熊蜂样品或含目的片段的 DNA质粒作为阳性对照。 10.2.2   使用未感染熊蜂孢子虫的熊蜂样品作为阴性对照。 10.2.3   使用双蒸水作为空白对照。 10.3 DNA 提取 10.3.1   每组选取5只～10只处死后的熊蜂或死后新鲜的熊蜂，剖取脂肪体组织，转入2.0   mL   研磨 管中，置于样品制备仪进行研磨处理，也可直接选取可疑虫体置于样品制备仪中进行研磨处理。 10.3.2   取研磨后的样本约25   mg转移至另一1.5   mL离心管中，加入50   µL   TE缓冲液，使样品充分 悬浮后，加入 60   µL   10%   SDS 溶液和 10   µL   20   mg/mL 的蛋白酶 K，混匀后于 37   ℃下温育 1   h。 10.3.3   加入 100   µL   5   mol/L 的 NaCl 溶液，上下颠倒充分混匀，加入 80   µL   CTAB/NaCl 溶液，混匀后 65   ℃温育 10   min ；加入 600   µL 氯仿 / 异戊醇（体积比为 24:1） ，混匀后 12   000   r/min 离心 5   min。 10.3.4   吸取上清液至另一干净离心管，加入等体积的酚 / 氯仿