ICS 11.220 CCS B 41 团体标准 T/CVMA 285—2025 牛布鲁氏菌与牛分枝杆菌双重实时荧光 PCR检测方法 Detection method of duplex real -time fluorescence PCR assay for Brucella bovis and Mycobacterium bovis 2025 - 9 - 30发布 2025 - 9 - 30实施 中国兽医协会 发布 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 285—2025 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中国兽医协会提出并归口。 本文件起草单位： 中国动物疫病预防控制中心、青海省动物疫病预防控制中心、广西壮族自治区动 物疫病预防控制中心、北京亿森宝生物科技有限公司、新疆生产建设兵团动物疫病预防控制中心、娄底 市动物疫病预防控制中心、江苏省动物疫病预防控制中心、确山县畜牧技术服务中心、开封市动物疫病 预防控制中心 。 本文件主要起草人： 孙雨、胡冬梅、李琦、宋晓晖、于宁卫、孙航、李晓霞、司国辉、邢薿文、邹 联斌、阚威、李静、郑思思、林元清、王新杰、孙晓明、高姗姗、袁晓涛、徐鹏、闫新博、郑辉、王斯、 张旭、剡文亮、刘洁琼、苏贵成、吴镜、谭庆辉、丁朝阳、王建、柴旭斓、王贞贞、谢军伟。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 285—2025 1 牛布鲁氏菌与牛分枝杆菌双重实时荧光 PCR检测方法 1 范围 本文件规定了牛布鲁氏菌与牛分枝杆菌双重实时荧光 PCR检测方法的原理、试剂材料、仪器用具、 样品采集处理和运输保存、样本提取、试剂制备、加样和结果判定等。 本文件适用于牛布鲁氏菌与牛分枝杆菌的特异性核酸检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 668 2 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 实时荧光 PCR：实时荧光聚合酶链式反应（ Real-time polymerase chain reaction ） BHQ：无荧光淬灭基团（ Black hole quencher ） bp：碱基对（ Base pair） Bru：牛布鲁氏菌 （Brucella bovis ） Ct值：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值所经历的循环数（ Cycle threshold ） DNA：脱氧核糖核酸 （Deoxyribonucleic acid ） FAM：6-羧基荧光素（ 6-carboxyfluorescein ） Mtb：牛分枝杆菌 （Mycobacterium bovis ） 5 试剂材料 5.1 试剂 5.1.1 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水应符合 GB/T 6682 中相关规定。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 285—2025 2 5.1.2 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸二钠（ pH 8.0）、50 %甘油生理盐水、 0.01 mol/L 磷酸缓冲液（ pH 7.6）、 4 %氢氧化钠、柠檬酸钠－磷酸缓冲液、 4 %硫酸溶液，配方见附录 A。 5.1.3 曲拉通 100。 5.1.4 DNA提取相关试剂见附录 A或其他等效 商品化核酸提取试剂。 5.1.5 实时荧光 PCR检测试剂为商品化试剂。 5.2 阳性对照 含有牛布鲁氏菌靶基因片段（参考序列见附录 B.1）、牛分枝杆菌靶基因片段（参考序列见附录 B.2） 其阳性对照按照附录 B.3制备。 5.3 阴性对照 按照附录 B.4制备。 5.4 引物和探针序列 引物和探针序列见附录 B。 6 仪器设备 高速冷冻离心机、电子天平、荧光 PCR仪、 -20 ℃低温冰箱、 pH计、磁力搅拌器、恒温水浴锅、高 压灭菌锅、超净工作台、可调移液器（ 2.5 μL，10 μL，20 μL，100 μL，200 μL，1000 μL）和各规格移 液器枪头、离心管、研钵等。 7 样品的采集和运输保存 7.1 样品的采集和处理要求 样品采集和处理应符合 NY/T 541 的要求。 7.2 样本的采集 7.2.1 全血样品 进行尾部静脉无菌 采血。采集静脉血时，每头牛使用一个注射器。无菌自动物静脉采血，将血液直 接滴入抗凝剂中，并立即连续摇动，充分混合。抗凝剂采用 0.5 mol/L 乙二铵四乙酸二钠（ pH 8.0）。每 6 mL血液加 1 mL抗凝剂。 7.2.2 牛奶样品 无菌采集早晨挤出的奶液的后段奶 10 mL于灭菌的容器中密闭送检。 7.2.3 痰液样品 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 285—2025 3 动物痰液采集：动物咯痰极少，宜在清晨采集，用橡胶管自口腔伸入至气管内，外接注射器吸取痰 液。亦可取咳出的痰块。用灭菌容器密闭送检。 7.2.4 组织样品 采集动物下颌、咽后、支气管、肺 (特别是肺门及肺门淋巴结 )、纵隔和肠系膜淋巴结，以及病变组 织器官如肝、脾。流产胎牛可无菌采集胎衣。 妊娠母牛 可无菌采集取胎膜组织。公牛 可无菌采集取睾丸 组织，放在含有保护液（ 50 %甘油生理盐水） 。组织样品应不少于 2 g，用灭菌容器密闭送检。 7.2.5 粪便样品 采集混有黏液、血液、黏膜的粪便，或用刮匙从动物直肠深部 (约30 cm)取少量黏液粪便于灭菌的 容器中密闭送检。 7.2.6 拭子样品 妊娠母牛用无菌拭子在子宫绒毛膜间隙反复采集渗出物 5 ~ 10次后放在含有保护液（ 50 %甘油生理 盐水）。流产母牛用无菌拭子反复采集阴道分泌物 5 ~ 10次后放在含有保护液（ 50 %甘油生理盐水） 。 密闭送检。 7.2.7 羊水样品 流产胎牛 可无菌采集羊水 10 mL于灭菌的容器中密闭送检。 7.2.8 细菌培养物 直接取液体培养基培养的菌液；对于在固体培养基上生长的菌落，用接种棒挑取适量 (取用量达到 肉眼可见，菌团大小不超过接种环 )菌样，放到 0.01 mol/L 磷酸缓冲液（ pH 7.6）中，振荡混匀形成悬浮 菌液。 7.3 样品保存和运输 待检样品在 2 ℃ ~ 8 ℃ 保存不应超过 24 h。样品采集后，置于加冰袋的保温箱中，密封， 24 h内送 至实验室进行检测。 如不能立即检测， 需将样品 注明采样点名称、 样品名称、 编号及样品数量 置于 -20 ℃ 低温冰箱保存。 -20 ℃保存不超过三个月； -80 ℃以下可长期保存。 7.4 样品的处理 7.4.1 全血样品的处理 取1 mL ~ 2 mL全血样品， 15000 g离心 10 min，弃上清。加等体积灭菌双蒸水充分振荡， 15000 g离 心10 min。弃上清，若红细胞裂解不完全，需采用灭菌双蒸水重复洗涤。收集沉淀物置 -20 ℃贮存备用。 7.4.2 牛奶样品的处理 取10 mL奶液， 加 100μL曲拉通 100，振荡混匀， 2500 g离心 20 min， 弃上清， 取沉淀。 加 1 mL 0.01 mol/L 磷酸缓冲液 （pH 7.6），充分振荡混匀。将沉淀悬浮液移入微量离心管， 15000 g离心 10 min， 弃上清，收集沉淀物置 -20 ℃贮存备用。 7.4.3 痰液样品的处理 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 285—2025 4 在痰液样品中加入 2倍 ~ 4倍体积 4 %氢氧化钠溶液， 振荡混匀， 室温放置 30 min， 间或振荡混匀， 使其充分液化 （无明显固状物并且吸出时无脱丝现象即为液化完全。若液化不完全，可适当再加入少量 4 %氢氧化钠溶液直至液化完全 ）。15000 g离心 10 min，弃上清，加 1 mL 0.01 mol/L 磷酸缓冲液 （pH 7.6），充分振荡混匀， 15000 g离心 10 min，弃上清，重复本步骤 1次。收集沉淀物置 -20 ℃贮存备用。 7.4.4 组织样品的处理 取适量组织样品（剔除脂肪、被膜），剪碎，按 1∶5的比例加入柠檬酸钠 -磷酸缓冲液（例如， 1 g 组织样品，加入 5 mL缓冲液），充分研磨。加等量 4 %氢氧化钠溶液，继续研磨 5 min ~ 10 min，使组织 液化。移入离心管，充分振荡， 75 ℃温浴 0.5 h ~ 1 h，取上清 (避免吸取粗渣 )，15000 g离心 10 min，弃 上清，加等量 0.01 mol/L 磷酸缓冲液 （pH 7.6），振荡混匀，使沉淀充