ICS 11.220 CCS B 41 团体标准 T/CVMA 287—2025 非洲猪瘟病毒微流控荧光 PCR检测方法 Microfluidic Real -time PCR detection method for African swine fever virus 2025 - 9 - 30发布 2025 - 9 - 30实施 中国兽医协会 发布 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 287—2025 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由 泰州蕾灵百奥生物科技有限公司 提出。 本文件由 中国兽医协会归口。 本文件起草单位： 泰州蕾灵百奥生物科技有限公司、牧原食品股份有限公司、中国农业科学院兰州 兽医研究所、江苏省农业科学院、扬州大学 。 本文件主要起草人： 陈蕾、刘婉思、骆焕东、成晶、刘振东、牛旻、张娇蕊、李亚楠、刘帅杰、张 强、杨吉飞、何继军、马维民、毛立、刘爵、陈政海 。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 287—2025 1 非洲猪瘟病毒微流控 荧光 PCR检测方法 1 范围 本文件规定了非洲猪瘟病毒 微流控荧光 PCR检测方法的 技术原理、试剂与耗材、仪器设备、操作方 法和结果判定 。 本文件适用于非洲猪瘟病毒核酸的检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 NY/T 1948 兽医实验室生物安全要求通则 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 ASFV：非洲猪瘟病毒（ African Swine Fever Virus ） BHQ1：无荧光淬灭基团 1（Black hole quencher 1 ） Ct值：每个 检测体系内 的荧光信号量达到设定的阈值所经历的循环数（ Cycle threshold ） DNA：脱氧核糖核酸 （Deoxyribonucleic acid ） FAM：6-羧基荧光素 （6-carboxyfluorescein ） HEPES：4-(2-羟乙基 )-1-哌嗪乙磺酸（ 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine -1-ethanesulfonic acid ） MAOPA ：磁珠介导的一体化聚合酶扩增 （Magnetic beads mediated All-in-One Polymerase Amplification ） PBS：磷酸盐缓冲液（ Phosphate buffered saline ） PCR：聚合酶链式反应（ Polymerase Chain Reaction ） ROX：羧基 -X-罗丹明（ Carboxy -X-rhodamine ） 5 原理 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 287—2025 2 本方法核心在于通过微流控卡槽式芯片技术将核酸提取与荧光 PCR检测整合为一体，由磁珠全流 程参与核酸的吸附、洗涤、洗脱和扩增，实现基于 MAOPA 技术的一体化分子检测。其中，微流控检 测卡盒作为加样和检测过程中的重要载体，在其不同功能区域（包括裂解、洗涤、扩增反应等）依次预 装填了相应试剂并密封后制备而成。微流控检测卡盒工作流程：检测时，样品随磁珠一同加入到卡盒的 裂解区域；之后卡盒放入到带有电磁功能、变温功能及实时荧光检测一体化的微流控荧光 PCR检测仪 器中，利用仪器的电磁控制模块，控制磁珠依次完成样品核酸的吸附、洗涤、洗脱和扩增反应，最后仪 器对卡盒扩增反应区域的基因扩增产物引起的实时荧光信号变化进行光学检测。 根据实时荧光信号的出 现时间、强度和位置，仪器自动判断样品中是否含有 ASFV核酸。 6 试剂与耗材 6.1 试剂 6.1.1 除特别说明以外，本文件所用试剂均为分析纯，试验用水符合 GB/T 6682 中二级水的要求。 6.1.2 洗涤液 Ⅰ，按照附录 A中A.1配制。 6.1.3 洗涤液 Ⅱ，按照附录 A.2配制。 6.1.4 裂解液，按照附录 A.3配制。 6.1.5 磁珠，按照附录 A.4配制。 6.1.6 针对 ASFV B646L 基因序列设计 的特异性引物和探针，并根据 外源性 DNA序列设计 的内标引 物和探针。 B646L基因参考序列 见附录 B.1，内标基因参考 序列见附录 C.1，引物和探针序列见附录 D 中表D.1。 6.1.7 阳性对照样品： 阳性重组大肠杆菌菌液 ，参考附录 B.2进行制备 。 6.1.8 阴性对照样品： ASFV核酸阴性的样品（如猪血清、血浆、 10 %组织匀浆或无核酸酶水等） 。 6.1.9 内标样品：内标重组大肠杆菌菌液 ，参考附录 C.2进行制备 。 6.1.10 其它商品化试剂：石蜡、硅油、 荧光 PCR预混液（ 2×）等。 6.1.11 无菌去离子水，符合 GB/T 6682 要求。 6.2 耗材 6.2.1 微流控检测 卡盒。 6.2.2 离心管（ 1.5 mL，无核酸酶） 。 6.2.3 微量移液器吸头 （10 μL、200 μL、1000 μL，无核酸酶） 。 7 仪器设备 7.1 二级生物安全柜。 7.2 微流控荧光 PCR检测仪器。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 287—2025 3 7.3 微量可调移液器（ 2.5 μL、10 μL、100 μL、200 μL、1000 μL等不同规格）。 7.4 组织研磨仪。 7.5 台式高速离心机。 8 样品采集、处理和储存 8.1 生物安全措施 样品采集 及运输的生物安全措施 按NY/T 541 的规定执行；样品处理、检测应在符合 GB 19489 、 NY/T 1948 的生物安全二级及以上且经省级畜牧兽医行政主管部门批准非洲猪瘟检测的实验室进行。 8.2 样品采集及运输 样品采集及运输按照 NY/T 541 的规定执行。采集猪血清、 血浆、口鼻拭子等液体样品，脾脏、扁 桃体、淋巴结、肾脏、骨髓、肌肉等组织样品， 圈舍、饲槽、运输工具和 周边环境 拭子等样品用于检测， 样品应在冷藏条件下尽快运输至实验室， 避免反复冻融。 8.3 样本处理 8.3.1 应在二级生物安全柜中处理检测前样品。 8.3.2 血清、血浆样品：无需处理，可直接吸取 上清待检 。 8.3.3 唾液样品： 充分涡旋震荡 30 s后， 5000 r/min离心 2 min，吸取上清 待检。 8.3.4 拭子（包括口鼻拭子、血拭子、肛拭子 、环境拭子 ）样品： 充分涡旋震荡含有拭子的管子 30 s， 尽力挤压拭子后， 5000 r/min离心 2 min，吸取上清 待检。 8.3.5 组织样品： 取约 0.1 g组织至 2 mL研磨管，加入 1 mL 0.01 mol/LPBS （pH 7.2），置组织研磨 仪充分研磨制成约 10 %组织匀浆液， 5000 r/min离心 5 min，吸取上清 待检。 8.3.6 精液样品：反复冻融 3次， 5000 r/min离心 2 min，吸取上清待检。 8.4 样品存放 采集或处理好的样品在 2 ℃ ~ 8 ℃保存应不超过 24小时；若需长期保存，须放置 −20 ℃以下保存， 并应避免反复冻融。 9 操作方法 9.1 扩增反应液的配制 将40 μmol/L ASFV 检测上游 引物和下游引物各 0.5 µL，20 μmol/L探针 0.4 µL，与40 μmol/L内标上游、 下游引物各 0.4 µL、20 μmol/L探针 0.3 µL，荧光 PCR预混液（ 2×）20 µL，无菌去离子水 17.5 µL混合均 匀。 9.2 微流控检测卡盒的制备 9.2.1 样品裂解区 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 287—2025 4 使用自动化灌装设备或手动将 1.2 mL裂解液灌装至空卡盒的样品裂解区，加入适量非活性液体（包 括但不限于硅油等）封闭该区，通过塑性材料活塞实现对该区的物理隔离并控制样品流向洗涤液 Ⅰ区。 9.2.2 洗涤液Ⅰ区 使用自动化灌装设备或手动将 140 μL洗涤液 Ⅰ灌装至空卡盒的洗涤液 Ⅰ区，加入适量非活性液体（包 括但不限于硅油等）封闭该区，通过塑性材料活塞实现对该区的物理隔离并控制样品流向洗涤液 Ⅱ区。 9.2.3 洗涤液Ⅱ区 使用自动化灌装设备或手动将 140 μL洗涤液 Ⅱ灌装至空卡盒的洗涤液 Ⅱ区， 加入适量非活性液体 （包 括但不限于硅油等）封闭该区，通过