SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 2722—2010 出血性败血症检疫技术规范 Quarantine protocol for haemorrhagic septicaemia 2010-11-01 发布 2011-05-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 2722—2010 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准采用重新起草法，修改采用国际动物卫生组织《陆生动物诊断试验和疫苗手册》（2009版）， 第2.4.12“出血性败血症”部分。主要的技术性差异如下： —对标准文本进行了调整； 对血清型鉴定方法进行细化和完善 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、中华人民共和国山西出人境检验检 疫局。 本标准主要起草人：宋阳威、郑志高、张常印、廉慧锋、李东明、易海华、王凯明、唐泰山、吴亚力、 张敬友。 SN/T 2722—2010 出血性败血症检疫技术规范 1范围 本标准规定了出血性败血症的病原鉴定和血清型鉴定方法的技术要求。 本标准适用于进出境牛出血性败血症的检疫和诊断。 2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 AGID（agar gel immunodiffusion Test）:琼脂免疫扩散试验 CIEP（counter immunoelectrophoresisTest)：对流免疫电泳试验 HS（haemorrhagic septicaemia）：出血性败血症 IHA（indirect haemagglutination Test):间接血凝试验 3疾病概述 出血性败血症病原学、流行病学、症状和病理变化、检疫及诊断参见附录A。 4检疫方法 4.1细菌分离和鉴定 4.1.1# 材料和试剂 4.1.1. 1 细菌分离培养基：见附录B 4.1.1.2细菌生化鉴定培养基和试剂：见附录B。 4. 1.2木 样品的采集 4.1.2.1采集动物死后数小时内的血液或心脏拭子。 4.1.2.2如果动物死亡时间较长，可取无组织长骨。 4.1.3样品的培养 4.1.3.1血液样品或2mL～3mL灭菌生理盐水拭子洗液接种于血琼脂平板，麦康凯琼脂平板，改良 马丁氏琼脂平板，置37℃培养24h 4.1.3.2无组织长骨表面用酒精拭后劈开，无菌抽取骨髓接种于血琼脂平板，麦康凯琼脂平板，改良 马丁氏琼脂平板，置37℃培养24h。 4.1.4细菌鉴定 4.1.4.1培养特性 1 SN/T 2722—2010 成光滑的、有灰色光泽的半透明菌落，直径约1mm。在改良马丁氏琼脂上划线分离可获得纯培养物。 老龄菌特别是在那些无血培养基上的，形成小菌落。在麦康凯琼脂培养基上不生长。 4.1.4.2细菌形态特征 血液涂片用革兰氏、亚甲蓝或利什曼法染色可见革兰氏阴性、短的、卵圆形、两极着染的球杆菌。有 时还有一定程度的多形性，尤其是在老龄培养物中，呈现不同长度的杆状。用亚甲蓝或利什曼法染色 时，两极着色更明显。 4.1.4.3生化特性 HS多杀性巴氏杆菌生化特性见表1。 表 1 HS 多杀性巴氏杆菌生化特性 产酸 过氧化 硫化氢 氧化酶 尿素酶 硝 柠檬 山梨 阿拉 麦芽糖 水杨苷 吲哚 酸盐 明胶 木糖 乳糖 葡 氢酶 酸盐 伯糖 萄 蔗糖 醇 糖 × + + 一 + (+) 十/ : 十/一 十/- (-) (-) 注：十：阳性反应；（十）：多数菌株；十/一：部分菌株；（一）：少数菌株；一：阴性反应 4.1.5结果的判定与解释 细菌培养特性、形态特征和生化特性符合4.1.4时，则判定为HS多杀性巴氏杆菌分离阳性 4.2血清型鉴定 4.2.1 快速玻片凝集试验（英膜分型） 4.2.1.1 材料和试剂 4.2.1.1.1多杀性巴氏杆菌A、B、D、E分型血清。 4.2.1.1.2参考菌株(6:B和6:E)。 4.2.1.1.3生理盐水。 4.2.1.1.4待测荚膜抗原型HS多杀性巴氏杆菌。 4.2.1.2操作方法 4.2.1.2.1将玻璃板划成每格3cm×3cm的区域，每一格下留少许位置，用于填写样品编号。 4.2.1.2.2上述各格标上待检样品编号，参考菌株血清型，每格加25L无菌生理盐水。 4.2.1.2.3用接种环挑取细菌纯培养物于玻片上的生理盐水中混匀，加一滴分型血清，混匀并缓慢加 热玻片。 4.2.1.3结果判定 4.2.1.3.1参考菌株的对照试验出现絮状凝集，则试验成立，可以判定。否则，本次试验无效。 4.2.1.3.2在30S内出现粗的絮状凝集者判为阳性。老龄培养物需要较长时间出现细的粒状凝集。 2 SN/T 2722—2010 4.2.2间接血凝试验（英膜分型） 4.2.2.1材料和试剂 4.2.2.1.1多杀性巴氏杆菌A、B、D、E分型血清。 细胞。 4.2.2.1.3待测HS多杀性巴氏杆菌1%荚膜抗原致敏红细胞（以下称1%致敏红细胞）：见附录C。 4.2.2.1.41%新鲜红细胞：见附录C。 4.2.2.1.596孔V型微量反应板。 4.2.2.1.60.3%福尔马林生理盐水。 4.2.2.2操作方法 4.2.2.2.1将多杀性巴氏杆菌A、B、D、E分型血清分别倍比稀释至第6孔，每次检测需设对照试验 组，包括阳性对照、阴性对照和空白对照试验。试验操作程序见表2。 表2HS多杀性巴氏杆菌间接血凝试验程序及结果判定举例 多杀性巴氏杆菌A、B、D、E分型血清稀释度 对照试验 成分 1 : 10 1 : 20 1 : 40 1 : 80 1:160 1: 320 阳性对照 阴性对照 空白对照 0.3%福尔马 林生理盐水 721 401 401 40 40 40 32 32 40 μL A、B、D、E 8J -40J -40J -40J -40J 40 8 8 血清/μL 弃去40 1%致敏 40 40 40 40 40 40 40 红细胞/μL 阳性致敏 40 红细胞 阴性致敏 40 红细胞 置反应板于微量振荡器上振荡1min，37℃或室温感作 结果判定 +++ +++ +++ ++ + ++++ 注：所示被检荚膜抗原凝集效价为1：160。 4.2.2.2.2 第一孔加入72μL0.3%福尔马林生理盐水，后面5孔各加40μL。 4.2.2.2.3将8μL血清加入第一孔，依次作倍比稀释至第6孔，最后弃去40μL。 4.2.2.2.4每孔中分别加40μL致敏红细胞。 4.2.2.2.5置反应板于微量振荡器上轻微振荡1min，混匀。 4.2.2.2.6将反应板加盖，置室温下感作2h～18h后观察结果。 3 SN/T 2722—2010 4.2.2.3结果判定 4.2.2.3.1凝集程度的判别标准 十十十十：红细胞全部凝集，形成均一的膜，布满整个孔底。 十十十：红细胞在孔底形成一层薄膜，但面积比前者小。 十十：红细胞在孔底形成薄层，边缘松散或呈锯齿状。 十：红细胞在孔底形成小圆点，周围有稀疏散在的少量凝集。 一：红细胞完全沉于孔底，形成小的光滑圆盘点。 4.2.2.3.2红细胞凝集效价 被检抗原产生“十十”红细胞凝集现象的最高稀释倍数为红细胞凝集效价。 4.2.2.3.3有效性判定 阳性对照：应为（十十十十）。 阴性对照：应为（一）。 空白对照：应无自凝现象，即（一）。 对照试验成立，可以判定。否则，本次试验无效。 4.2.2.3.4结果判定 被检血清检测结果按以下标准判断： 红细胞凝集效价为1：160及以上，判为阳性； 一红细胞凝集效价为1：40及以下，判为阴性； 红细胞凝集效价介于1：40与1：160之间的，判为可疑。 被检血清如出现可疑结果的，应作复检，复检结果仍为可疑的，判为阳性。 4.2.3平板凝集试验（菌体分型） 4.2.3.1材料和试剂 4.2.3.1.1待检HS多杀性巴氏杆菌菌体抗原：见附录C。 4.2.3.1.3标准HS多杀性巴氏杆菌（参考菌株6：B和6：E)的抗菌体抗原血清。 4.2.3.2操作方法 4.2.3.2.1将玻璃板划成每格3cm×3cm的区域，每一格下留少许位置，用于填写样品编号。 4.2.3.2.2上述各格标上待检样品编号，标准抗原血清型，每格加25uL平板凝集抗原。 4.2.3.2.3在各格凝集抗原旁分别加人抗血清25μL。 4.2.3.2.4用牙签或移液器枪头使抗血清与凝集抗原混匀并形成直径约2cm的液区。轻微晃动，室 温下于4min内观察结果。 4.2.3.3结果判定 4.2.3.3.1当标准HS多杀性巴氏杆菌菌体抗原对照出现凝集，标准阴性抗原不出现凝集时，则试验 成立，可以判定。否则，本次试验无效。 4.2.3.3.2在4min内出现肉眼可见凝集现象者判为阳性，不出现凝集者判为阴性。 4 SN/T 2722—2010 4.2.4琼脂免疫扩散试验 4.2.4.1材料和试剂 4.2.4.1.1荚膜分型凝胶：见附录C。 4.2.4.1.2菌体分型凝胶：见附录C。 4.2.4.1.3标准HS多杀性巴氏杆菌16型菌体分型血清。 4.2.4.1.4标准HS多杀性巴氏杆菌A、B、D、E荚膜分型血清 4.2.4.1.5待检HS多杀性巴氏杆曲荚膜抗原：见附录C。 4.2.4.1.6待检HS多杀性巴氏杆菌菌体抗原：见附录C。 4.2.4.1.7标准菌体分型抗原和标准荚膜分型抗原。 4.2.4.1.8标准阴性荚膜抗原和标准阴性菌体抗原。 4.2.4.2操作方法 4.2.4.2.1打孔 在制备好的琼脂板上（分别用荚膜分型凝胶和菌体分型凝胶制作）用直径4mm的梅花形打孔器打 方向将琼脂挑出，勿伤边缘，避免琼脂层脱离平皿底部。 4.2.4.2.2