SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 2973—2011 鲍鱼立克次氏体病检疫技术规范 Quarantine protocol for xenohaliotis californiensis 2011-09-09发布 2012-04-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 （数码防信） 中华人民共和国出入境检验检疫 行业标准 鲍鱼立克次氏体病检疫技术规范 SN/T 2973-2011 * 中国标准出版社出版 北京复兴门外三里河北街16号 邮政编码：100045 网址www.spc.net.cn 电话：68523946 68517548 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷 * 开本880×12301/16 ：印张1字数25千字 2012年3月第一版 2012年3月第一次印刷 印数1—1600 * 书号：155066·2-23042 SN/T 2973-2011 前言 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。 本标准与国际动物卫生组织（OIE)《水生动物疾病诊断手册》（2009年版）中第2.4.7章Infection withXenohaliotisCaliforniensis”一致性程度为非等效。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国山东出人境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫 局、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：岳志芹、赵玉然、吴斌、刘、李叶、辛学谦、史秀杰、苏永生、梁成珠。 SN/T2973—2011 鲍鱼立克次氏体病检疫技术规范 1范围 本标准规定了鲍鱼立克次氏体病的组织病理学观察、PCR方法和原位杂交检疫技术规范。 本标准适用于鲍鱼立克次氏体病的常规检测，适用于本病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T18088出人境动物检疫采样 3设备与试剂 3.1设备 3.1.1 普通光学显微镜。 3.1.2 一80℃低温冰箱。 3.1.3 组织研磨器。 3. 1. 4 切片机。 3.1.5 PCR仪。 3.1. 6 电泳仪。 3.1.7 凝胶成像仪或紫外观察灯。 3. 2 试剂 3.2.1 染色剂：常规涂片及组织学染色剂（有关染液见附录A）。 3.2.2 蛋白酶K(见附录A)。 3.2.3 石蜡。 3.2.4 二甲苯。 3.2.5 无水乙醇。 3.2.6 75%的乙醇。 3.2.7 硫酸镁（MgSO，）。 3.2.8 dNTP。 3.2.9 TaqDNA聚合酶及PCR缓冲液（附录A）。 3.2.10 DNA 2000 Marker。 3.2.11 核酸染料（EB)。 3.2.12 琼脂糖。 3.2.13 Davidson's固定液（附录A）。 3.2.141 PCR产物纯化试剂盒。 3.2.15地高辛标记试剂盒。 SN/T2973—2011 4样品的采集 4.1样品的选择 根据GB/T18088规定的数量采样，匀浆后取样品25mg~100mg置于1.5mL离心管中。为了优 化检测，采取针对性抽样，需要选择表现为体重下降、足部肌肉萎缩临床症状的鲍鱼。 4.2样品的保存 样品保存在乙醇（体积比1：9)中，可存放于4℃～20℃；或用液氮速冻；或存放于一80℃超低温冰 箱中。样品运输时需用干冰保存 4.3采样器官和组织 最佳的采样组织是后食道，其次是消化腺、 5检测方法 5.1组织学诊断方法 5.1.1切取若干3mm～5mm的后食道、消化腺和足部肌肉的截面，将其放在Davidson's固定液中 24h然后制作常规石蜡组织切片，固定液的体积应至少为组织体积的10倍。 5.1.2切片用苏木精-伊红染色，在光学显微镜下观察后食道和消化腺中的细菌内含体（长椭圆形， 14μm～56μm的适碱性胞浆内空泡），以及消化腺和定部的形态变化。建议放大200倍或400倍进一 步观察切片。 5.2聚合酶链式反应(PCR) 5.2.1采样部位 后食道或者是消化腺，推荐后食道的组织，因为通常后食道的感染比消化腺的感染更严重。 5.2.2核酸的抽提 用经典的酚三氯甲烷萃取法(见附录B)或者商业化DNA提取试剂盒。 5.2.3引物的设计 引物序列如下： RA 5-1:5'-GTT-GAA-CGT-GCC-TTC-AGT-TTA-C-3'; RA 3-6:5'-ACT-TGG-ACT-CAT-TCA-AAA-GCG-GA-3" 该PCR引物可以特异的扩增鲍鱼立克次氏体病原体的→个158pb大小的片段。 5.2.4PCR扩增体系 PCR扩增在标准的20μL的反应体系中进行，包括1×PCR缓冲液，1.5mmol/LMgCl2，400ng/ml BSA，200μmol/L的dNTPs，10pmol/L引物各0.5μL，1.6U的Taq聚合酶和100ngDNA模板。 5.2.5PCR反应条件 95℃预变性5min，而后95℃1min，62℃30s和72℃30s循环40次，最后72℃10min。 2 SN/T2973—2011 5.2.6扩增产物的检测 用1.5%琼脂凝胶电泳和溴化乙锭染色检测158bp的扩增产物。 5.2.7对照的设立 5.2.7.1阳性对照：含有鲍鱼立克次氏体的DNA或含扩增片段的质粒。 5.2.7.2空白对照：PCR时不加样品但是包括其他主要混液的反应体系。 5.2.8结果判定 在158bp大小处，阳性对照有扩增条带，空白对照没有扩增条带，即阳性对照、空白对照均成立的 条件下，若样品在阳性对照处有扩增察带.则判断为疑似阳性，反之，判断为阴性。 5.2.9序列的测定 PCR产物应通过序列测定来对检测结果进行最终确证，序列参照立克次氏体的16SrDNA序列 (GenBankAccessionAF133090），参见附录C。 5.3原位杂交技术（ISH） 5.3.1探针 探针序列如下： RA 5-1:5'-GTT-GAA-CGT-GC-TTC-AGT-TTA-C-3" RA 3-6:5'-ACT-TGG-ACT-CAT-TCA-AAA-GCG-GA-3^, RA 3-8:5'-CCA-CTG-TGA-GTGGTTATC-TCC-TG-3' RA 5-6:5'-GAA-GCA-ATA-TTG-TGA-GAT-AAA-GCA-3 探针由地高辛标记。 5.3.2操作步骤 5.3.2.1去壳后，取食道、消化腺新足部肌肉机切面（3jmm～5mm）置手Davidsons固定液中24h~ 48h，然后转人70%的乙醇中进行红织处理。通过70%、80%、85%、90%、95%、100%乙醇梯度洗脱各 2h，进行脱水，空气晾干。100%乙醇与二甲苯浸泡1H进行透明处理，甲苯浸泡2h。65℃～70℃石 蜡中浸蜡1h后包埋。用石蜡切片机逊行切片，厚度5μm用毛笔将切片移人展片机内展片，用经 500μg/ml多聚赖氨酸包被的载玻片捞起，置于烘片机42℃烘烤30min。 5.3.2.2组织切片（包括阳性对照和阴性对照）依次通过二甲苯（3次，5min/次）、无水乙醇（2次， 1min/次）、95%乙醇（2次，1min/次）、85%乙醇（2次，约1min/次）、50%乙醇（约1min）、蒸馏水冲洗 6次（勿让切片干燥）。 5.3.2.3组织切片平放在湿盒中，吸500μL蛋白酶K工作液（见附录A)于每张组织切片上，37℃下 温浴15min。 5.3.2.5室温下，用2×SSC(见附录A）浸洗组织切片5min。 5.3.2.6> 将上述组织切片平放在湿盒中，吸500μl.杂交缓冲液（见附录A)于每张组织切片上，42℃ 温浴30min。 5.3.2.7按每张切片需要25ng核酸探针计算，取出总核酸探针需用量，置于一只微量离心管中，在 100℃沸水中煮探针10min，而后置于冰水中快速冷却。 SN/T2973—2011 5.3.2.8取5.3.2.7中的核酸探针与相应量（每张切片需500uL)的杂交缓冲液充分混合，吸500μl 溶有核酸探针的杂交缓冲液，滴加于每张组织切片上，然后将组织切片置于85℃90℃切片烘片机上 保温6min~10min，使组织DNA变性。 5.3.2.9将组织切片放在冰上快速冷却2min~5min。 5.3.2.10在湿盒内40℃～42℃下温浴过夜（16h～18h）。 5.3.2.11吸去组织切片上溶有核酸探针的杂交缓冲液，然后在染色缸中，用缓冲液2×SSC(15min， 室温）、1×SSC(5min，室温）、0.5×SSC（2次，15min/次，42℃）、缓冲液I（5min，室温）浸洗组织切片。 5.3.2.1237℃下用缓冲液Ⅱ封闭组织切片（500μL/片），温浴30min。 5.3.2.13吸去组织切片上的缓冲液Ⅱ，用缓冲液Ⅱ按1：1000(1μL/mL）稀释碱性磷酸酶标记的地 高辛抗体（Anti-DIG-AP），把组织切片平放在湿盒中，每片组织切片上加250μL稀释的Anti-DIG-AP， 37℃下孵育30min。 5.3.2.14吸去组织切片上的缓冲液Ⅱ，在染色缸中，依次用1×缓冲液I（2次，10min/次，室温）和 1×缓冲液Ⅲ（5min，室温）浸洗组织切片。 5.3.2.15每片组织切片上加500L显色液I（见附录A），室温下黑暗中温浴1h～3h。在显色过程 中，可短时间取出组织切片在显微镜下观察，当阳性对照明显显色时可终止反应。 终止反应。 5.3.2.17在染色缸中，组织切片依次通过蒸