ICS65.160 YC CCS X 87 中华人民共和国烟草行业标准 YC/T 627—2025 烟草品种鉴定技术规程 SSR分子标记法 Technical code of practice for tobacco varieties identification- SSR marker method 2025-06-30发布 2025-10-01实施 国家烟草专卖局 发布 中国标准出版社 出版 YC/T627—2025 前言 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由国家烟草专卖局提出。 本文件由全国烟草标准化技术委员会农业分技术委员会（SAC/TC144/SC2)归口。 本文件起草单位：中国农业科学院烟草研究所、国家烟草基因研究中心、云南省烟草农业科学研究院、 贵州省烟草科学研究院、湖北省烟草科学研究院、湖南省烟草科学研究所。 本文件主要起草人：任民、刘国祥、杨爱国、孙洋洋、张剑锋、李媛、蔡长春、余世洲、程立锐、肖炳光、 郭玉双、曹培健、胡日生。 I YC/T627—2025 烟草品种鉴定技术规程 SSR分子标记法 1范围 本文件规定了利用简单重复序列（SimpleSequenceRepeats，SSR）标记进行烟草（Nicotianataba cumL.)品种鉴定的操作程序、结果统计和结果判定。 本文件适用于烟草品种SSR指纹数据采集和品种鉴定。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于 本文件。 GB/T3543.2农作物种子检验规程第2部分：扦样 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 NY/T2594植物品种鉴定DNA分子标记法总则 YC/T369植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南烤烟 3术语和定义 NY/T2594界定的术语和定义适用于本文件。 4原理 不同烟草品种基因组中等位SSR的长度存在差异，这种差异可通过PCR扩增及电泳方法进行检 测，进而区分不同的烟草品种。 5主要仪器设备及试剂 主要仪器设备及试剂按附录A。 6溶液配制 溶液配制按附录B。 7引物相关信息 引物名单及序列见附录C，引物相关信息见附录D。 8参照品种 参照品种相关信息见附录E。 YC/T627—2025 9操作程序 9.1样品准备 送验样品可为种子、幼苗、叶片等个体、组织或器官，需要扦样时样品数量应符合GB/T3543.2的 规定。每份样品取不少于15个个体的叶片或其他等效物，混合分析，必要时进行单个个体检测。 9.2DNA提取 采用CTAB法提取DNA，具体操作步骤如下 a）取种子、幼苗、叶片等组织或器官200mg~300mg，置于2.0mL离心管，加液氮充分研磨； 每管加人600μL65℃预热的CTAB提取液充分混合，65℃恒温水浴45min~60min，每间隔 10min颠倒混一次， c） 每管加人等体积的三氯甲烷-异戊醇（24:1,体积比）,轻缓混匀后，静置10min； d）4℃12 000 r/mm离心15min后，吸取上清液至新的离心管,再加人等体积预冷的异丙醇，颠 倒离心管数次，在一20℃放置30min;4℃，12000r/min离心10min，弃上清液； e) 用70%（体积分数）乙醇洗涤DNA沉淀2次，风于加人100PL水（A2.1）或TE缓冲液，检 测DN浓度和质量20C保存 注：以上为推荐的DNA提取方法所获DN人质量能够满足PCR扩增要求的其他DVA提取方法均适用。DNA溶 液在260mm和280nm的紫外吸光度ODz60 百280的值介于！ 2.0 9.3PCR扩增 9.3.1 反应体系 PCR扩增反应体系的总体积和各组分的终浓度参照表1配制可依据试验条件调整 表1PCR扩增反应体系 反应组分 原浓度 终浓度 推荐体积/μL 10X缓冲液(含MgCl) 10× 1X 2.0 dNTPS 10mmol/L 0.2mmol/L 0.4 TaqDNA聚合酶 5U/μL 0.05U/mL 0.2 上游引物 10 μmol/L 025μmol/L 0.5 下游引物 10 μmol/L 0.25μmol/L 0.5 DNA 25 ng/μL 2.5 ng/μL 2.0 水(A.2.1) 14.4 总体积 20.0 TaqDNA聚合酶为普通酶,可采用PCR试剂盒代替TaqDNA聚合酶、dNTP、Mg2 9.3.2反应程序 95℃预变性5min；95℃变性40s,54℃退火45s，72℃延伸40s，共35个循环；72℃延伸10min， 2 YC/T627—2025 产物4℃保存。 9.4PCR产物检测 9.4.1变性聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳（PAGE) 9.4.1.1制胶 蘸洗涤剂用清水将玻璃板清洗干净，再用水（A.2.2）、75%（体积分数）乙醇分别擦洗2遍。玻璃板 干燥后，将1mL亲和硅烷工作液均匀涂在长玻璃板上，将1mL疏水硅烷工作液均匀涂在带凹槽的短 玻璃板上，玻璃板干燥后，将0.4mm厚的塑料隔条整齐放在长玻璃板两侧，盖上凹槽短玻璃板，用夹子 固定，用水平仪检查是否水平。取80mL6%PAGE胶溶液，加人60μLTEMED和180μL10%的过 硫酸铵（过硫酸铵的用量与室温成反比，需根据室温调整用量），轻轻摇匀（勿产生大量气泡），将胶灌满 玻璃胶室，在凹槽处将鲨鱼齿梳的平齐端向里轻轻插入胶液5mm~6mm。胶液聚合1.5h后，清理胶 板表面溢出的胶液，轻轻拔出梳子，用水清洗干净备用。 注：能够满足SSR分析检测要求的预制成品胶板也能用于后续电泳。 9.4.1.2预电泳 将聚合好的胶板安装于电泳槽上，在电泳正极槽（下槽）加人600mL的1XTBE缓冲液，负极槽 （上槽）加入600mL的1×TBE缓冲液，在1800V恒压预电泳10min~20min。 9.4.1.3变性 在20μLPCR产物中加人4μL6×加样缓冲液，混匀。在PCR仪上95℃变性5min，取出迅速置 于冰上，冷却10min以上。 9.4.1.4电泳 用移液器清除凝胶顶端气泡和杂质。将样品梳插人凝胶1mm～2mm。每一个加样孔点入3μL~ 5μL样品，在胶板一侧点人DNAMarker。1800V恒压电泳，电泳时间参考二甲苯青指示带移动的位 置和扩增产物预期片段大小范围（见附录D）。二甲苯青指示带在6%PAGE胶电泳的移动位置与 230bp扩增产物泳动的位置大致相当。扩增产物片段大小在（100士30)bp、(150土30)bp、（200土30)bp、 （250士30)bp范围的电泳参考时间分别为1.5h、2.0h、2.5h、3.5h。电泳结束后关闭电源，取下玻璃板 并轻轻撬开，凝胶附着在长玻璃板上。 9.4.1.5银染 将粘有凝胶的长玻璃板胶面向上浸人“固定/染色液”中，轻摇染色槽，使“固定/染色液”均匀覆盖 胶板，置于摇床上染色5min~10min。将胶板移人水（A.2.2）中漂洗30s~60s。再移人显影液中，轻 摇显影槽，使显影液均勾覆盖胶板，待带型清晰，将胶板移人水（A.2.2）中漂洗5min，晾干胶板，放在胶 片观察灯上观察记录结果，用数码相机或凝胶成像系统拍照保存。 9.4.2毛细管电泳 9.4.2.1样品准备 在DNA分析仪专用96孔上样板中选取一孔加人24μL的DNA分析仪用分子量内标，其余孔分 别加人2μL的PCR扩增产物和22μL的DNA分析仪用电泳缓冲液。 3 YC/T627—2025 9.4.2.2等位变异检测 打开DNA分析仪，检查仪器工作状态和试剂状态，将装有样品的96孔上样板放置于样品架基座 上，打开数据收集软件，按照仪器使用手册，编辑样品表，执行运行程序，DNA分析仪将自动运行，并保 存电泳原始数据。 10结果统计 10.1等位变异命名 每个SSR位点的等位变异以扩增片段大小为依据进行命名 10.2 变性聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳 根据参照品种的迁移位置，确定待测样品该位点的等位变异。 10.3毛细管电泳检测 使用毛 毛细管电泳检测设备的片段分析软件，读出待测品种与对应参照品种的等位变异数据。比较 参照品种的等位变异大小数据占表11中参照品种相应的数据，两者之间的差值为系统误差。可通过 左右整体位移调整，使参照品种数据皮取己知结果相一致以校正不间电泳板的系统误差。 10.4结果记录 纯合位点的等位变易 异大小数据记为X 其中×为该位点等位变异的大小；杂合位点的等位变异 大小数据 记录为X/Y，其电 别为该位点上的两 等位变异的人小，小片段数据在前，大片段数 据在后。 缺失位点的等位变异关小数据记录为8/0。 示例1：样品在某个位点上仅出现个等位变是：大小为160bp，则该位点的等位变异数据记录为160/160。 示例2：样品在某个位点上有两个等位变异分别为1606165bp，则该位点的等位变异数据记录为160/165。 11 结果判定 11.1 判定规则 当样品间差异位点数2，判定为“不同”；当样品间差异位点数<2判定为“疑同”。当品种间差异 位点数<2，按照YC/T369的规定进行田间鉴定。 11.2结果表述 待测样品 与对照样品 （或数据库中 已知品种）采用 检测平台，检测位点数为 差异位点数为 ，判定为 YC/T627—2025 附录A （规范性） 主要仪器设备及试剂 A.1主要仪器设备 A.1.1I PCR扩增仪。 A.1.2 高压