ICS 65.160 YC CCSX 87 中华人民共和国烟草行业标准 YC/T 628—2025 烟草品种鉴定技术规程 SNP标记法 Technical code of practice for tobacco varieties identification- SNP marker method 2025-06-30发布 2025-10-01实施 国家烟草专卖局 发布 中国标准出版社 出版 YC/T628—2025 前 言 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由国家烟草专卖局提出。 本文件由全国烟草标准化技术委员会农业分技术委员会（SAC/TC144/SC2）归口。 本文件起草单位：郑州烟草研究院、贵州省烟草科学研究院、中国农业科学院烟草研究所、云南省 烟草农业科学研究院。 本文件主要起草人：张剑锋、金静静、罗朝鹏、余世洲、任民、童治军、许亚龙、谢小东、李泽锋、徐馨、 卢鹏、陶界锰、武明珠、王中、李锋、杨军、曹培健、谢贺、白戈、肖炳光、杨爱国、雷波、杨志晓、赵会纳。 1 YC/T628—2025 烟草品种鉴定技术规程SNP标记法 1范围 本文件描述了利用单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism，SNP）标记进行普通烟草 （NicotianatabacumL.）品种鉴定的操作程序、数据记录与统计、判定方法。 本文件适用于烟草品种的SNP指纹数据采集及品种鉴定。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于 本文件。 GB/T21138 烟草种子 NY/T2594# 植物品种鉴定DNA分子标记法总则 YC/T369 植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南烤烟 3术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4原理 不同烟草品种的基因组DNA存在核苷酸序列差异，其中单个核苷酸变异引起的这种多态性差异 称之为SNP。SNP标记具有分布密度高、检测通量高、数据整合易等特点，不同品种的SNP位点基因 可通过扩增及芯片扫描等技术进行检测，从而能够区分不同品种。 5主要试剂 5.1DNA提取试剂盒。 5.2SNP芯片试剂盒。 63 主要仪器设备 样品粉碎仪或研磨机。 6.2 恒温孵育器或水浴锅。 6.3# 涡旋振荡器。 6.4微量移液器。 6.5PCR扩增仪。 6.6离心机。 6.7电泳仪。 1 YC/T628—2025 6.8凝胶成像仪。 6.9核酸浓度测定仪。 6.10杂交炉。 6.11SNP芯片分型仪。 7标记 SNP标记相关信息见附录A。 8操作程序 8.1样品准备 8.1.1从烟草品种材料中抽取的个体的数量应满足NY/T2594的要求。 中对烟草种子纯度的要求。 8.2DNA提取与检测 利用DNA提取试剂盒提取样本基因组DNA。提取与纯化的DNA溶液在260nm与230nm处 的吸光度值的比值介于1.5~2.0；在260nm与280nm处的吸光度值的比值介于1.8~2.0;DNA电泳 主带明显，无明显降解和RNA残留；DNA浓度>10ng/μL。 注：能够达到相应质量要求的DNA提取方法都适用于本文件。 8.3SNP指纹数据采集 8.3.1基因组DNA变性及扩增。取200ng样品基因组DNA变性后，分别加入SNP芯片试剂盒中 扩增混合液、扩增聚合酶，置于37℃杂交炉中恒温孵育24h进行全基因组扩增，65℃孵育20min终止 扩增反应。 8.3.2DNA片段化及沉淀。分别加人片段化缓冲液、片段化稀释液、片段化酶，置于37℃杂交炉中恒 温孵育30min进行片段化反应，随后加入终止液终止反应。加人沉淀液，混匀后再加入异丙醇，封膜 后转人一20℃冰箱，沉淀DNA。 8.3.3DNA干燥和重悬。离心后倒掉上清液，将沉淀置于37℃杂交炉中20min进行干燥。随后加入 重悬缓冲液，重悬溶解DNA。 8.3.4杂交。分别加人杂交缓冲液、杂交液，95℃变性10min后，立即置于48℃的金属保温板中。吸 取样本加人芯片加样区，置于SNP芯片分型仪中杂交24h。 8.3.5芯片扫描。分别加人染色液和缓冲液至对应位置。运行SNP芯片分型仪，完成连接、染色、洗 涤和扫描工作。进行数据分析处理，同时保存原始文件。 注：以上操作程序仅为推荐方法，其他能达到同样位点分型效果的方法也可采用。 9数据记录 根据SNP标记位点的分型效果，剔除或留用该位点的数据。数据记录为X/X或X/Y,其中XY 为该位点的单核苷酸，如A、TC、G，按此顺序排列。无效数据记录为一/一。 个样品的有效数据所占比例若<95%，不予采用。 2 YC/T628—2025 10 结果分析 10.1结果计算 按附录A中标记检测，获得待测样品在各标记位点的DNA指纹数据，利用这些数据进行品种间 的遗传相似度比较。遗传相似度按式（1）计算： GS= ..(1) Ni 式中： GS一待测品种与对照品种的遗传相似度； nj 一一待测品种与对照品种中均检出，但基因型无差异的有效SNP位点数目； N，一一待测品种与对照品种中均检出的有效SNP位点数目。 10.2结果判定 当样品间遗传相似度96%，则判定为“不同品种”；当样品间遗传相似度>96%，判定为近似品 种或疑同品种”。 对于“近似品种或疑同品种”的样品，按YC/T369的规定进行田间种植进一步鉴定。 3 YC/T628—2025 附录A （规范性） SNP标记 SNP标记见表A.1。参考基因组为红花大金元V1.2。 表A.1SNP标记 序号 染色体 位置 正负链 序列 ACTAATTAAAAAATAACTAAGGTGCAAAGTAAATC[T/C] S1 1 602184 TAGTGAAACATAATAATATCTGACAACGAAATATG TTTGAACTCTGATGGGCTCGACTAAATAACAATCA[C/T] S2 1 2328654 GGTGAATTTAGTGGGTAGTTAATACAAGCCTCTGT ATGCACGTTTGCCTAAGACCTTGGAATCAGCTGTA[C/T] S3 1 3233714 TACTTGATGCTCAATATATTGCTTGTGGAAGCACA AAGAACCATCACAATTGTGAAGTCATCCACATTTC[T/C] S4 6045225 GTTGCCTTCGCAAATTGCGAAGGTAAGTTTGCAAA AGCATUSTANGTACAAAGCTATTAACATTTCAGOA[A/G] S5 7289665 CONNNATC TTTCAGCAGCAAAATCAGCATTT GG AKECCAAG TGCAGCACCOTTACCAATACCAAAAIG/A) S6 8165810 SAAGATOOCCGATATTCCTAAATATGATGGG CAAATGTAOAATAAGTATAAACGCT CAACTTTCAA[T/C] S7 9763770 IGGATAAAACATGCCAAGAGACTGGAACAAACCCT ATGAAATATAAGTCAAAGTACCAATATGGAATAAA[C/G] S8 11443707 ATAAAAATAATTTAGTAAAACACGAACAAGNAATA TCTAGAGAAATGGTGGAGAAGTTGAG TGTAGAAC[C/T] S9 1 12281249 GAGAGGCAAGGAGCACGTTTTATCTCGTTTAATCC CAGATGGAATTAATCATAAGCTTAACTCAAGGAAT[C/A] S10 13070704 AGATAAATCAAGATCTCACTACATATTCATCAAGT TACTAAAGCCAGATGGACCAGAACCGACAAAAGAA[C/G] S11 1 14230693 CTCGACAGCAGCACGCCAATTCAGAAGCGCATCAC TGGAAATCCCTTAATTTTGATACCACTGCTCTAAG[C/A] S12 15640723 TGCGATAATATCAATTGGCTAGATGCCATCAAACA TTCTATATATATGGGACCTTTTTTCTTAGAAAACC[C/G] S13 16677682 TAATAGTACAAATATTAGGAATATTCACTAGAATA TGGTACACCGCCGATATCTTGTGAGATAACGTCAA[T/G] S14 1 19061473 GTGCTTTGTCACGAGGAGGGACTTTGCGTTAGAGA AACGTAGTCTGCTGCCTCCGTGAGAGAAAGCCCTT[C/T] S15 20993318 ATACTCCATTAGAGCAGCCACATCTCTCGCTACAG ATTTTTTAGCAAAGTTGATAGGGTAACATGTGACT[T/C] S16 22439721 AGCACTATCAACTTAACGTCAGAAAGATCATTTTC 4 YC/T628—2025 表A.1 SNP标记（续） 序号 染色体 位置 正负链 序列 TTTACGCTGAATCCGGAGGAGGATTTCATCTCAAG[G/A] S17 1 23343377 + GATGTGATGTAAGGAGCCTACTCTGATACACG