ICS 07.060; 13.060 HY Z 17 中华人民共和国海洋行业标准 HY/T 1512013 海洋微藻中溶血毒素的检测 血细胞法 Detection of hemolytic toxins in marine microalgae-Erythrocyte lysis assay 2013-04-25发布 2013-05-01实施 国家海洋局 发布 中华人民共和国海洋 行业标准 海洋微藻中溶血毒素的检测 血细胞法 HY/T151—2013 * 中国标准出版社出版发行 北京市朝阳区和平里西街甲2号(100013) 北京市西城区三里河北街16号（100045） 网址：www.gb168.cn 服务热线：010-51780168 010-68522006 2013年6月第一版 * 书号：155066·2-25465 版权专有 侵权必究 HY/T 151—2013 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家海洋局南海环境监测中心提出。 本标准由全国海洋标准化技术委员会（SAC/TC283）归口。 本标准起草单位：国家海洋局南海环境监测中心、暨南大学 本标准主要起草人：李秀芹、杨维东、黄楚光、徐志斌、高阳、彭颖慧、上官茂森、林端、方宏达、吴进孝、 董燕红、陈嘉辉、吴玲玲、曲念东、刘洁生。 一 HY/T151—2013 海洋微藻中溶血毒素的检测血细胞法 1范围 本标准规定了用血细胞法检测海洋微藻中溶血毒素活性的方法及技术要求， 本标准适用于自然海水中海洋微藻细胞中溶血毒素的检测，也适用于实验室培养的海洋微藻细胞 中溶血毒素的检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB17378.3一2007海洋监测规范第3部分：样品采集、贮存与运输 HY/T069一2005赤潮监测技术规程 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3. 1 海洋微藻 marinemicroalgae 海水中粒径大于2um的浮游植物。 3. 2 溶血毒素 hemolytictoxins 一类主要由微藻产生能够导致机体红细胞及其他真核细胞裂解的糖脂类物质，其主要作用于敏感 细胞的细胞膜脂质部分。 3.3 溶血活性 hemolytic activity 溶血毒素溶解血细胞的效力。 3. 4 溶血单位 hemolytic units 用来表述溶血毒素活性的量纲。1个溶血单位相当于在1mL反应系统中（含柠檬酸缓冲液 0.15mL、0.5%的兔血红细胞0.80mL和溶血毒素粗提液0.05mL），在37℃水浴30min使红细胞溶 解50%时所需溶血毒素的量，相当于（1.30士0.39）μg洋地黄皂苷。 3. 5 血细胞法 erythrocytelysisassay 针对溶血毒素破坏、溶解血细胞的特性建立的一种检测方法，该方法以溶血单位为量纲来定量溶血 毒素的溶血活性。 3. 6 赤潮水样 羊red tidewater 微藻细胞浓度达到或超过HY/T069一2005规定的基准浓度的海水样品。 1 HY/T151—2013 3.7 非赤潮水样 non-red tide water 微藻细胞浓度未达到HY/T069一2005规定的基准浓度的海水样品。 4原理 再以甲醇溶液溶解残留物，得溶血毒素粗提物；用粗提物溶解血细胞，同时配置洋地黄皂苷标准系列溶 液绘制工作曲线，结合粗提物的溶血情况计算溶血毒素的活性。 5试剂和材料 除非另作说明，本标准所用试剂均为分析纯，水是蒸馏水或者等效纯水。 5.1氯仿（CHCla）。 5.2F 甲醇(CH.O)。 5.3柠檬酸（CH:O，·H2O)。 5.4 洋地黄皂苷（Cs6Hg2O29，99%）。 5.5 5氯化钠（NaCI)。 5. 6 柠檬酸钠（CH,Na:O，·2HO）。 5.7 葡萄糖（CH12O）。 5.8 曲拉通X-100（C4H62O1）。 5. 9 医用肝素钠注射液［（C12HNS2Nag）20，5000IU/mL]。 5.10提取液：氯仿、甲醇和水体积比为13：7：5。 5.11柠檬酸溶液（2mol/L）：称取柠檬酸（CHsO，·H2O)42.0g，置于200mL烧杯中，用水溶解后 移人100mL容量瓶中，稀释至刻度，摇匀备用。 5.12洋地黄皂苷母液（10μg/mL）：称取洋地黄皂苷1.0mg，置于200mL烧杯中加水搅拌至溶解（必 要时可水浴加热），移入100mL容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，备用， 5.13柠檬酸缓冲液：称取0.8532g氯化钠（NaCI),2.1680g柠檬酸钠（C,H,NasO，·2HzO)，4.5180g 葡萄糖（C,H12O），置于500mL烧杯中，用水溶解，用柠檬酸溶液（5.11)调pH值至7.0，移人250mL 容量瓶中，稀释至刻度，摇匀备用。 5.14免血红细胞溶液（0.5%，体积比）：取健康新西兰免新鲜血液10mL，加入微量医用肝素钠注射 液，以1200r/min的转速离心10min，弃上清液，加入柠檬酸缓冲液（5.13），轻轻摇匀后再次同条件离 心，去上清液，反复三遍，直到上清液无色，根据离心后血细胞体积，用柠檬酸缓冲液（5.13）配成0.5% 血细胞溶液，当天使用。 6 仪器设备 6.1分光光度计：需有540nm的吸收波段。 6.2烘箱。 6.3超声波细胞粉碎仪：配直径为2mm的变幅杆，超声功率可达200W。 6.4天平：感量0.1g。 6.5分析天平：感量0.1mg。 6.6光学显微镜：配有可放大倍数为40倍、100倍的物镜和目镜 2 HY/T151—2013 6.7循环水式多用真空泵：极限真空度大于25kPa。 6.8旋转蒸发器：配200mL旋转蒸发瓶，蒸发温度可达40℃。 6.9电热恒温水浴锅：有室温到100℃的可调温度。 6.10pH计：测量范围为0～14。 6.11可调微量移液器：0.05mL、0.1mL、0.2mL和1mL。 6.12梨形分液漏斗：50mL。 6.13纤维素酯微孔滤膜：孔径0.45μm，直径50mm。 6.14过滤器：滤头直径60mm，配250mL滤杯，1000mL滤瓶。 6.15离心机：最高转速不小于3000r/min。 7样品采集与处理 7.1样品采集与浓缩 按照GB17378.3一2007的规定采集表层海水样品。对于赤潮水样，采集1L；对于非赤潮水样，采 集10L；对于实验室培养藻液，直接量取微藻处于对数生长期的样品200mL。 样品宜立即在3000r/min的转速下离心10min，或用孔径为0.45μm的纤维素酯微孔滤膜过滤 （过滤负压不应超过50kPa），浓缩水样收集微藻细胞，立即测试，或0℃保存3d内测试。 7.2微藻细胞毒素粗提 7.2.1破碎细胞：取上述样品（7.1），加人提取液（5.10)10mL，置于冰上，放人超声波细胞粉碎机的隔 音箱内，超声功率调为200W，超声时间为5S，间隔时间为6s，工作时间为20min，取微量破碎液在显 微镜下观察，若无完整细胞即可进行下一步，若有完整细胞则再次同条件超声破碎，直到镜检无完整 细胞。 7.2.2萃取：将破碎的微藻细胞（7.2.1)倒人梨形分液漏斗中，静置30min，待溶液分层后，用旋转蒸 发瓶收集下层溶液。 7.2.3减压蒸馏：下层溶液40℃下旋转蒸发至干，冷却至室温，待溶解。 7.2.4溶解：加人1mL甲醇，摇荡使旋转蒸发瓶壁的物质完全溶解，吸出溶液，即为毒素粗提物，立即 测试。 8分析步骤 8.1工作曲线的制作 8.1.1将八支10mL离心管洗净，后用水润洗三遍后，放置于烘箱内80℃干燥20min，取出冷却后， 放置于冰上。量取洋地黄皂苷母液（5.12)0,0.10mL，0.15mL，0.20mL，0.25mL，0.30mL，0.35mL，依 次加入上述七支离心管中，量取0.10mL曲拉通X-100加入到第八支离心管中；再依次加入柠檬酸缓 0.40mL柠檬酸缓冲液（5.13)的离心管为阴性对照，加入0.10mLT曲拉通X-100的离心管为阳性对 照（全溶血）。分别取摇匀后的0.5%兔血红细胞溶液（5.14)1.60mL，依次加人上述离心管中。 8.1.2所有离心管置于37℃水浴锅内，30min后取出，以800r/min的转速离心10min，取上清液 用分光光度计在波长540nm处检测吸光度值A，，阴性对照吸光度值为A。，阳性对照吸光度值为A。。 按式(1)计算得出工作曲线溶血百分数P。 A. = A×100% P, = ...(1 ) A. 3