ICS65.020.30 CCSB43 54 西藏自治区地方标准 DB54/T0574—2026 细粒棘球绦虫快速检测方法 CRISPR-Cas12a 2026-1-4发布 2026-2-5实施 西藏自治区市场监督管理局  发布DB54/T0574—2026 I目次 前 言............................................................................II 1范围.................................................................................1 2规范性引用文件.......................................................................1 3术语和定义...........................................................................1 4仪器材料与试剂.......................................................................1 5操作方法.............................................................................2 附录A（资料性）目标扩增序列....................................................4 附录B（资料性）引物及浓度......................................................5 附录C（规范性）PCR反应体系配置.................................................6 附录D（资料性）颜色检测结果判定................................................7 附录E（资料性）荧光值检测结果判定..............................................8DB54/T0574—2026 II前言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由西藏自治区农业农村标准化技术委员会提出并归口。 本文件起草单位：西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所、佛山大学。 本文件主要起草人：唐文强、黄福强、石斌、赵霞玲、马弘财、罗润波、孙建春、张明珠。DB54/T0574—2026 1细粒棘球绦虫快速检测方法CRISPR-Cas12a 1范围 本文件规定了细粒棘球绦虫CRISPR-Cas12a检测的仪器耗材与试剂、操作方法及结果判定等要求。 本文件适用于实验室对细粒棘球绦虫的快速检测。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB19489实验室生物安全通用要求 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 CRISPR-Cas12a CRISPR全称为ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats，中文翻译为“成 簇的规律间隔短回文重复序列”，是细菌的适应性免疫系统。Cas全称为CRISPRassociatednuclease， 指CRISPR相关核酸酶，Cas12a效应蛋白又称为Cpf1效应蛋白，是一种由可编程RNA引导的DNA核酸酶，属 于Ⅱ类V型CRISPR/Cas系统。 细粒棘球绦虫 一种在世界范围内流行的人畜共患慢性寄生虫，属圆叶目（Cyclophyllidea）带科（Taeniidae） 棘球属（Echinococcus）绦虫，可引起囊型棘球蚴病（cysticechinococcosis,CE）。 4仪器材料与试剂 仪器 以下仪器用于细粒棘球绦虫样本的保存、灭活和试验处理。 a)实时荧光恒温扩增仪、恒温培养箱等任意一种可以恒温在37℃的仪器； b)微量移液器（1μL～10μL，20μL～200μL，200μL～1000μL）； c)掌上离心机：最高转速不小于8000rpm； d)冷冻式离心机：最高转速不小于15000rpm； e)涡旋震荡仪； f)-80°超低温冰箱；DB54/T0574—2026 2g)实时荧光恒温扩增仪、荧光定量PCR仪、蓝光照胶仪、验钞灯等任意一种可以实时检测荧光信号 或可发出蓝/紫光的仪器设备。 材料 以下材料用于细粒棘球绦虫样本的PCR试验。 a)0.2mL透明顶盖PCR反应管； b)离心管（1.5mL）； c)一次性移液器吸头； d)冰盒。 试剂 粪便基因组DNA提取试剂盒，LbCas12a核酸酶，反应缓冲液CleavageBuffer，荧光探针reporter， RPA试剂盒，阴性质控：ddH2O，阳性质控：含有目标核酸片段的质粒制品，见附录A；crRNA及RPA引物 序列及配制的母液浓度见附录B。 5操作方法 生物安全措施 检测过程中不得直接接触待检样品，个人防护及废弃物处置应按照GB19489的规定处理。 样品采集和处理 样品采集和处理应当符合GB19489实验室生物安全通用要求,并遵循以下操作。 a)采集含细粒棘球绦虫组织的病料、细粒棘球绦虫组织/虫卵污染的环境样本或新鲜犬粪200mg～ 500mg，放入1.5mL离心管中，冷藏运至实验室，-80℃保存,待提取DNA； b)含细粒棘球绦虫成虫或虫卵的样品提取DNA前应先放置于-80℃超低温冰箱冷冻不少于7天，以灭 活病原； c)使用通用型基因组DNA提取试剂盒提取含棘球绦虫/蚴组织样本全基因组，使用粪便基因组DNA提 取试剂盒提取含棘球绦虫成虫或虫卵的粪便样品全基因组； d)提取好的全基因组置于4℃保存，若不能当天检测，应放于冰箱冷冻室-20℃保存。 检测前准备 将所用恒温设备调至37℃预热。若为实时荧光恒温扩增仪或荧光定量PCR仪，将其扩增温度设置为 37℃，扩增时间为30min，且每分钟读取一次荧光。 检测过程 CRISPR-Cas12a法检测核酸的操作方法如下。 a)将CRISPR/Cas12a酶、反应缓冲液CleavageBuffer和荧光探针reporter置于冰盒上彻底融化，RPA 反应液置于室温彻底融化，上下颠倒6次～7次混匀； b)30μL，体系。按照附录C配制反应体系； c)配制好反应体系后盖紧离心管，上下颠倒6次～7次，瞬离； d)将反应管置于37℃恒温条件下开始反应。 结果判定DB54/T0574—2026 35.5.1判定方法 法检测细粒棘球绦虫核酸的结果，采用如下方法进行检测。 a)可视法检测：同批反应的阳性对照在蓝/紫光灯照射下能观察到反应溶液变为黄绿色，且阴性对 照溶液为无色透明； b)荧光法检测：使用实时荧光恒温扩增检测仪或荧光定量PCR仪读取结果，同批反应的阴性对照荧 光值处于稳定状态，而阳性对照荧光值呈明显上升趋势且荧光值明显大于阴性对照。 5.5.2结果判断 CRISPR-Cas12a法检测细粒棘球绦虫核酸的结果，采用如下方法判定。 a)可视法检测：反应30min后在蓝/紫光下观察，试管溶液颜色由无色透明变为黄绿色的样本判定为 细粒棘球绦虫核酸阳性；反之，仍为无色透明的样本判定为阴性；若颜色为淡绿色、浅绿色则判定为可 疑，见附录D。 b)荧光法检测：使用实时荧光恒温扩增检测仪或荧光定量PCR仪读取结果，30min内荧光值呈明显上 升趋势的样本判定为细粒棘球绦虫核酸阳性；反之，30min无任何上升趋势的样本判定为阴性；若上升 趋势不明显，仅略高于阴性荧光值的样品判定为可疑，见附录E。 c)可疑样本再次取样进行检测，若再次检测为阴性，应重复扩增检测1次，2次阴性判定为阴性；若 再次检测仍为可疑或阳性，则判定为阳性。DB54/T0574—2026 4AA 附录A （资料性） 目标扩增序列 >NC_044548.1:3424-4005Echinococcusgranulosusmitochondrion,COX2gene（此序列来源于 NCBI的RefSeq数据库中细粒棘球绦虫参考线粒体基因组的COX2基因序列） GTGAAATTGTCGTTGTTATATTATGATATTGTGTGTTATATTGTGGCGGTTTGTGTATTTATTGTTTGTTTTGTGTATGTTTTGT TGTGTTGGAATGTGGTGTTTGGCGTTGGTACTGTTAAATTTGGTAGTGAGAATCAGATTATAGAGTTGGTATGAACTGTTATTCCTACT GTGGTTGTGTTAGTTTTGTGTGCCTTGAAAGTTAAATTTATTACTAGTGATTTAGATTGTTTTTCTTCTGAGACTATTAAGGTGGTTGG TCATCAGTGATATTGGACTTACGAGTATTTTGGCGGTGGCTATGATTCGTTTCCGATTGGGGATTATTTTGTGGTAGATAAGCCTTTGC GGATGGTTTATGGTGTACCATATCATTTGGTTGTAACTTCAAGTGATGTAATTCATTCGTTTTCT