2 0 2 5 1 2 0 9 发 布 － － 2 0 2 6 0 5 0 1 － － 实 施 油 菜 籽 中 甾 醇 含 量 的 测 定 分 光 光 度 法 0 4 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 0 2 0 . 0 1 C C S B 4 7 8 2 — 2 0 2 5 D e t e r m i n a t i o n o f s t e r o l c o n t e n t i n r a p e s e e d — S p e c t r o p h o t o m e t r i c m e t h o d Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４７８２—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部种植业管理司提出并归口. 本文件起草单位:中国农业科学院油料作物研究所、农业农村部油料产品质量安全风险评估实验室 (武汉)、农业农村部油料及制品质量检验测试中心. 本文件主要起草人:李培武、王督、张良晓、马飞、汪雪芳、张文、喻理、白艺珍、姜俊. ⅠNY/T４７８２—２０２５ 油菜籽中甾醇含量的测定　分光光度法 １　范围 本文件描述了采用分光光度法测定油菜籽中甾醇含量的原理、试剂和材料、仪器和设备、分析步骤和 结果计算. 本文件适用于油菜籽中甾醇含量的测定. 本文件甾醇检测线性范围为１０００mg/kg~８０００mg/kg. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB５４９１　粮食、油料检验　扦样、分样法 GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 ３　术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义. ４　原理 试样用氢氧化钾乙醇溶液皂化,经液液萃取得到甾醇溶液,与氧化酶溶液和显色液反应生成有色产 物,在波长４５０nm处有特征吸收,其吸光度值与甾醇含量成正比. ５　试剂和材料 除非另有说明,本方法所用试剂为分析纯,实验室用水符合GB/T６６８２中二级水的规定. ５􀆰１　试剂 ５􀆰１􀆰１　正己烷(C６H１４,CAS号:１１０Ｇ５４Ｇ３). ５􀆰１􀆰２　二甲基亚砜[(CH３)２SO,CAS号:６７Ｇ６８Ｇ５]. ５􀆰１􀆰３　乙醇(C２H６O,CAS号:６４Ｇ１７Ｇ５). ５􀆰１􀆰４　氢氧化钾(KOH,CAS号:１３１０Ｇ５８Ｇ３). ５􀆰１􀆰５　胆固醇氧化酶(CAS号:９０２８Ｇ７６Ｇ６):纯度＞１０U/mg,－２０℃保存. ５􀆰１􀆰６　蔗糖(C１２H２２O１１,CAS号:５７Ｇ５０Ｇ１). ５􀆰１􀆰７　牛血清白蛋白(CAS号:９０４８Ｇ４６Ｇ８). ５􀆰１􀆰８　柠檬酸(C?H?O?,CAS号:７７Ｇ９２Ｇ９). ５􀆰１􀆰９　磷酸氢二钠(Na２HPO４,CAS号:７５５８Ｇ７９Ｇ４). ５􀆰１􀆰１０　四甲基联苯胺(C１６H２０N２,CAS号:５４８２７Ｇ１７Ｇ７). ５􀆰１􀆰１１　辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG:浓度:１mg/mL,工作效价１∶５０００~１∶７５００,４℃保存. ５􀆰２　试剂配制 ５􀆰２􀆰１　样品提取液:称取１２􀆰０g氢氧化钾(５􀆰１􀆰４)于１０mL水中,用乙醇(５􀆰１􀆰３)定容至１００mL,溶液应 呈无色或淡黄色. ５􀆰２􀆰２　样品稀释液:二甲基亚砜乙醇(４∶１,V/V)混合溶液. １NY/T４７８２—２０２５ ５􀆰２􀆰３　缓冲液:取２􀆰０g蔗糖(５􀆰１􀆰６)和０􀆰５g牛血清白蛋白(５􀆰１􀆰７)溶解于１００mL水中,现配现用. ５􀆰２􀆰４　氧化酶溶液:取１kU胆固醇氧化酶(５􀆰１􀆰５)、３２μL辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG (５􀆰１􀆰１１)溶解于４０mL缓冲液(５􀆰２􀆰３),现配现用. ５􀆰２􀆰５　显色液:称取５􀆰０mg四甲基联苯胺(５􀆰１􀆰１０)溶解于２􀆰５mL乙醇(５􀆰１􀆰３)中,再加入３７􀆰３２g柠 檬酸(５􀆰１􀆰８)、７３􀆰６４g磷酸氢二钠(５􀆰１􀆰９)用水定容至２０００mL,现配现用. ５􀆰３　标准品 βＧ谷甾醇(βＧSitosterol,CAS号:８３Ｇ４６Ｇ５),纯度≥９５％. ５􀆰４　标准溶液配制 ５􀆰４􀆰１　标准储备溶液 准确称取βＧ谷甾醇(５􀆰３)标准品(精确至０􀆰０００１g),用乙醇(５􀆰１􀆰３)配制成浓度为５０mg/mL的标准 溶液,在－２０℃保存,有效期６０d. ５􀆰４􀆰２　标准工作溶液 移取适量的标准储备溶液(５􀆰４􀆰１)于５mL容量瓶中,以样品稀释液(５􀆰２􀆰２)定容,配制成浓度为 １mg/mL、２mg/mL、４mg/mL、６mg/mL和８mg/mL的系列标准工作溶液,４℃保存,现配现用. ６　仪器和设备 ６􀆰１　分光光度计:波长４５０nm,配１􀆰０mL比色皿. ６􀆰２　分析天平:感量０􀆰００１g和０􀆰０００１g. ６􀆰３　恒温箱:(３７±１)℃. ６􀆰４　涡旋混合器. ６􀆰５　研磨仪:研磨管配３mm钢珠. ６􀆰６　移液器:２０μL~２００μL、１００μL~１０００μL. ６􀆰７　离心机:转速≥４０００r/min. ６􀆰８　分样筛:２０目. ７　分析步骤 ７􀆰１　试样制备 按GB５４９１的规定进行扦取和分样,样品粉碎至全部通过分样筛(６􀆰８),充分混合; ７􀆰２　试样提取 称取０􀆰５g试样(精确至０􀆰００１g)于研磨管中,加入３mL样品提取液(５􀆰２􀆰１),用研磨仪(６􀆰５)研磨提 取３min,冷却后将提取液全部转移至１５mL离心管中,加入２mL水,混匀;加入３mL正己烷(５􀆰１􀆰１), 涡旋混匀,４０００r/min离心３min,移取２mL上层溶液,加入１mL样品稀释液(５􀆰２􀆰２),涡旋混匀, ４０００r/min离心３min,移取２００μL下层溶液到离心管中,待测. ７􀆰３　标准曲线 分别移取６０μL１mg/mL、２mg/mL、４mg/mL、６mg/mL和８mg/mL的标准工作液(５􀆰４􀆰２)于比 色皿中,依次加入１００μL氧化酶溶液(５􀆰２􀆰４)和２００μL显色液(５􀆰２􀆰５),混匀,置于恒温箱(６􀆰３)内反应 ３min,在４５０nm处测定吸光度值,以标准品吸光度值为纵坐标,标准工作溶液(５􀆰４􀆰２)浓度(mg/mL)为 横坐标,绘制标准曲线. ７􀆰４　测定 移取６０μL待测液,测定同７􀆰３.同时做试剂空白(不称取样品,步骤同７􀆰２),并根据样品提取液的吸 光度(扣除试剂空白吸光度)计算甾醇含量. 若样品吸光度值高于标准工作溶液的吸光度值范围,应酌情减少称样量或将样品稀释后重新测定. ２NY/T４７８２—２０２５ ８　结果计算 试样中甾醇含量按公式(１)计算. X＝c×n×V×１０００ m(１) 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 式中: X———试样中甾醇含量的数值,单位为毫克每千克(mg/kg); c———从标准工作曲线上得到甾醇浓度的数值,单位为毫克每毫升(mg/mL); n———试样的稀释倍数; V———试样测定液体积的数值,单位为毫升(mL); m———试样质量,单位为克(g). 试样结果中甾醇含量以βＧ谷甾醇计,计算结果以重复性条件下获得的２次独立测定结果的算术平均 值表示,结果保留４位有效数字. ９　精密度 ９􀆰１　重复性 在重复条件下,获得的２次独立测定结果的相对偏差不应超过算术平均值的２０％. ９􀆰２　再现性 在再现性条件下,获得的２次独立测定结果的相对偏差不应超过算术平均值的２５％. ３