2 0 2 5 1 2 0 9 发 布 － － 2 0 2 6 0 5 0 1 － － 实 施 猪 繁 殖 障 碍 性 病 毒 六 重 P C R 检 测 方 法 4 1 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 1 1 . 2 2 0 C C S B 4 8 2 1 — 2 0 2 5 A h e x a - p l e x P C R m e t h o d f o r s i m u l t a n e o u s d e t e c t i o n o f v i r u s e s c a u s i n g p o r c i n e r e p r o d u c t i v e d i s o r d e r s Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４８２１—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部畜牧兽医局提出. 本文件由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC１８１)归口. 本文件起草单位:江苏省农业科学院、贵州大学、扬州大学、常熟市畜禽屠宰检疫和城区动物防疫 中心. 本文件主要起草人:谢星、郝飞、曾智勇、庞茂达、刘文博、冯志新、陈蓉、李洋静、张磊. ⅠNY/T４８２１—２０２５ 引　　言 猪繁殖障碍疫病是一类以母猪和公猪繁殖性疾病为特征的传染病,引起妊娠母猪流产、死胎、木乃伊 胎、弱仔、畸形胎、产仔数低,母猪发情障碍、返情、不孕,公猪精液品质下降等,给生猪养殖造成严重经济损 失.在猪场常发的病毒性繁殖障碍疫病中,以猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒２ 型(PCV２)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)和日本脑炎病毒(JEV)等病原较为常 见.这些病原感染所致的临床症状类似,且常呈混合感染,给疫病的临床诊断和净化造成较大困难. 本文件针对PRV、PPV、PCV２、PRRSV、CSFV和JEV６种病毒,建立一种在一个反应体系中可同时 鉴别出６种病毒单一或混合感染的经济适用的多重PCR检测方法,为临床准确检测提供标准化、规范化 的操作方法. ⅡNY/T４８２１—２０２５ 猪繁殖障碍性病毒　六重PCR检测方法 １　范围 本文件规定了猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒２型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒和 日本脑炎病毒的六重PCR检测方法和操作程序. 本文件适用于对引起猪繁殖障碍的病毒进行检测. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 GB１９４８９　实验室生物安全通用要求 NY/T５４１　兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 ３　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件. ３􀆰１ 猪繁殖障碍性病毒　virusescausingporcinereproductivedisorders 可引起母猪、公猪繁殖障碍相关疾病的病毒.临床上,以猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒 (PPV)、猪圆环病毒２型(PCV２)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)和日本脑炎病毒 (JEV)６种最为常见. ４　缩略语 下列缩略语适用于本文件. CSFV:猪瘟病毒(classicalswinefevervirus) DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid) JEV:日本脑炎病毒(japaneseencephalitisvirus) PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction) PCV２:猪圆环病毒２型(porcinecircovirustype２) PPV:猪细小病毒(porcineparvovirus) PRRSV:猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus) PRV:伪狂犬病病毒(pseudorabiesvirus) RNA:核糖核酸(ribonucleicacid) TCID５０:组织半数感染量(tissuecultureinfectivedose５０％) ５　样品采集、处理、保存和运输 ５􀆰１　仪器设备 ５􀆰１􀆰１　高压或煮沸的剪刀、镊子、解剖刀具等解剖器材. ５􀆰１􀆰２　组织匀浆机或研钵. ５􀆰１􀆰３　超声波裂解仪. １NY/T４８２１—２０２５ ５􀆰１􀆰４　高速冷冻离心机. ５􀆰２　试剂材料 ５􀆰２􀆰１　PBS溶液. ５􀆰２􀆰２　一次性无菌注射器(５mL、１０mL)及针头;真空采血管;棉签;无菌离心管(２mL、１０mL);无菌密 封袋或密封容器;工作服;一次性手套;采样记录单;记号笔;防水标签;封口膜;冰袋. ５􀆰３　样品采集和处理 ５􀆰３􀆰１　样品采集 在样品采集处理过程中,应戴好一次性手套、口罩和防护帽.样品采集按NY/T５４１规定的方法采 样,各病原待检样品优先级按照表１. 表１　临床样品采集列表 病原 样品采集 CSFV　病死猪:扁桃体、淋巴结、胰脏、脾脏、回肠、肝脏和肾脏 　活猪:血清、扁桃体 PCV２　濒死猪、扑杀的育肥猪和流产胎儿:肺脏和淋巴结 　仔猪:心脏 　活猪:血清 PRRSV　濒死猪、扑杀猪:肺脏、脾脏、淋巴结、扁桃体 　公猪精液 　活猪:血清、口腔液、扁桃体 PRV　病死或剖杀猪:脑组织(含三叉神经节)、扁桃体 　活猪:血清、鼻拭子、扁桃体 　公猪精液 PPV　流产胎儿、木乃伊胎的实质器官:如心、肝、脾、肾、肺 　流产母猪:阴道分泌物 　活猪:血清 JEV　病死猪及流产胎儿:脑组织(选大脑皮质、脑干、中脑、海马回及桥脑) 　病死公猪:肿胀或萎缩的异常睾丸 　活猪:血清、脑脊髓液 ５􀆰３􀆰２　样品处理 ５􀆰３􀆰２􀆰１　血清:待２mL血液凝固后,取上清放于离心管中,４℃３５００r/min离心取血清. ５􀆰３􀆰２􀆰２　精液:取精液０􀆰５mL,冻融２次或超声波裂解,１００００r/min离心１０min,取上清液. ５􀆰３􀆰２􀆰３　组织:取待检组织样本２􀆰０g于灭菌的组织研磨器中充分研磨后,加入适量的PBS溶液,制成混 悬液,４℃３０００r/min离心１５min,取上清液转入无菌离心管中,对样本进行编号. ５􀆰３􀆰２􀆰４　拭子:拭子样品悬浮于１mLPBS溶液中,混匀成悬浮液. ５􀆰３􀆰２􀆰５　实验室培养物:取实验室培养物０􀆰５mL,冻融３次,１００００r/min离心１０min,取上清液. ５􀆰３􀆰２􀆰６　流产胎儿、木乃伊胎的实质器官:去掉表面筋膜,用研钵研碎,加入灭菌PBS制成１:５的悬液, 加入１％青链霉素,４℃过夜处理,冻融３次,３０００r/min离心１０min,取上清液. ５􀆰３􀆰２􀆰７　流产母猪的阴道分泌物:用无菌棉拭子轻轻旋转插入流产母猪阴道２cm~４cm刮取阴道内 容物,阴道拭子放入离心管,用２mL灭菌PBS浸润,反复挤压后,３０００r/min离心１０min,取上清液. ５􀆰４　保存与运输 将采集的样品随冰袋或干冰一起放入送样箱,密封后,使用７５％酒精对送样箱表面进行消毒,于 ２℃~８℃下２４h内完成运送工作.如样品不能被及时送到实验室,应置于－２０℃以下保存.具体样品 保存与运输参照NY/T５４１操作. ６　六重PCR方法 ６􀆰１　仪器设备 ２NY/T４８２１—２０２５ ６􀆰１􀆰１　生物安全柜. ６􀆰１􀆰２　CO２培养箱. ６􀆰１􀆰３　－７０℃冰箱. ６􀆰１􀆰４　高速冷冻离心机. ６􀆰１􀆰５　自动化核酸提取仪. ６􀆰１􀆰６　PCR仪. ６􀆰１􀆰７　水平电泳槽. ６􀆰１􀆰８　凝胶成像系统或紫外透射仪. ６􀆰１􀆰９　冰箱:２℃~８℃和－２０℃. ６􀆰１􀆰１０　微量加样器(量程:０􀆰５μL~１０μL;２μL~２０μL;２０μL~２００μL;１００μL~１０００μL). ６􀆰２　试剂材料 ６􀆰２􀆰１　核酸染料、DNA相对分子量标准物DL２０００. ６􀆰２􀆰２　商品化DNA/RNA提取试剂盒. ６􀆰２􀆰３　具有反转录和扩增功能的商品化一步法RTＧPCR试剂盒. ６􀆰２􀆰４　六重PCR引物,引物序列及溶解方法按照附录A的规定执行. ６􀆰２􀆰５　０􀆰０１mol/LPBS溶液(pH７􀆰２~pH７􀆰４),配制方法按照附录B中B􀆰１的规定执行. ６􀆰２􀆰６　１×TAE电泳缓冲液(pH８􀆰０),配制方法按照B􀆰２的规定执行. ６􀆰２􀆰７　焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水,配制方法按照B􀆰３的规定执行. ６􀆰２􀆰８　６×上样缓冲液,配制方法按照B􀆰４的规定执行. ６􀆰２􀆰９　２％的琼脂糖凝胶,配制方法按照B􀆰５的规定执行. ６􀆰２􀆰１０　参考毒株:PRV(以GZＧZ１株为例)、PPV(以NJ株为例)、PCV２(以GZＧRH１株为例)、PRRSV (以GZＧKY１为例)、CSFV(以CVCCAV１４１２株为例)和JEV(以SA１４Ｇ１４Ｇ２株为例),来源于国家菌种资 源库或有相关病原研究资质的科研院所提供的其他株均可. ６􀆰２􀆰１１　Vero细胞、BHKＧ２１细胞、ST细胞、PKＧ１５细胞和MarcＧ１４５细胞生长液与维持液. ６􀆰３　对照样品制备 ６􀆰３􀆰１　阳性对照样品的制备:参考毒株JEV用B