2 0 2 5 1 2 0 9 发 布 － － 2 0 2 6 0 5 0 1 － － 实 施 饲 料 中 7 种 抗 生 素 滤 渣 的 鉴 别 4 6 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 1 2 0 C C S B 4 8 4 0 — 2 0 2 5 I d e n t i f i c a t i o n f o r 7 k i n d s o f a n t i b i o t i c f e r m e n t a t i o n r e s i d u e s i n f e e d s Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４８４０—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部畜牧兽医局提出. 本文件由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC７６)归口. 本文件起草单位:中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所[国家饲料质量检验检测中心(北 京)]、中国农业大学、上海市动物疫病预防控制中心、江苏农林职业技术学院、新疆农业大学、新疆维吾尔 自治区畜牧科学院、中国农业科学院饲料研究所、中国农业科学院北京畜牧兽医研究所、江苏省农业科学 院、布鲁克(北京)科技有限公司、河南全印检测技术有限公司、信阳市农业综合行政执法支队、河南牧业经 济学院、河南联牧兽药有限公司. 本文件主要起草人:樊霞、杨增玲、索德成、陈爱亮、吴自军、樊克锋、韩鲁佳、黄士新、郑文新、冯玉超、 李守学、曹莹、李阳、宫平、肖志明、常选妞、李俊、沈广辉、刘晓露、赵跃、葛辰俊、樊宇航、陆唯、石创业、 张娟、陶亚飞、严凤、黄家莺、栾雪瑶、李润娴. ⅠNY/T４８４０—２０２５ 饲料中７种抗生素滤渣的鉴别 １　范围 本文件描述了饲料中抗生素滤渣的显微红外光谱、液相色谱高分辨质谱、实时荧光PCR鉴别方法. 本文件中的显微红外光谱法适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料、饲料原料和混合型饲料添加剂 中金霉素、土霉素、泰乐菌素、泰万菌素、新霉素、青霉素和阿维菌素滤渣的鉴别. 本文件中的液相色谱高分辨质谱法适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料、饲料原料和混合型饲料 添加剂中金霉素、土霉素、泰乐菌素、泰万菌素、新霉素和青霉素滤渣的鉴别. 本文件中的实时荧光PCR法适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料、饲料原料和混合型饲料添加剂 中土霉素、新霉素、青霉素和阿维菌素滤渣的鉴别. 本文件的检出限均为１％. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T６０４１　质谱分析方法通则 GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 GB/T８３２２　分子吸收光谱法术语 GB/T１３９６６　分析仪器术语 GB/T２０１９５　动物饲料试样的制备 SN/T１１９３　基因检验实验室技术要求 ３　术语和定义 GB/T６０４１、GB/T８３２２、GB/T１３９６６界定的以及下列术语和定义适用于本文件. ３􀆰１ 抗生素滤渣　antibioticfermentationresidue 生物发酵生产抗生素产品过程中产生的固态废弃物. ３􀆰２ 余弦相似度　cosinesimilarity 两个光谱向量的夹角余弦值. 注:用于衡量光谱间的差异大小,余弦相似度值越接近１,说明两个光谱越相似. ３􀆰３ 阈值　threshold 根据余弦相似度判断待测光谱是否和目标光谱相似的临界值. ４　通则 试样应同时选择显微红外光谱法、液相色谱高分辨质谱法、实时荧光PCR法进行检测. ５　显微红外光谱法 ５􀆰１　原理 利用显微红外成像系统采集样品的显微红外光谱,计算样品显微红外光谱与抗生素滤渣显微红外参 １NY/T４８４０—２０２５ 比光谱的余弦相似度,根据阈值鉴别样品中抗生素滤渣的存在. ５􀆰２　试剂或材料 ５􀆰２􀆰１　阳性对照样品:至少含有５％(质量分数)目标抗生素滤渣的饲料样品. ５􀆰２􀆰２　阴性对照样品:不含目标抗生素滤渣的饲料样品. ５􀆰３　仪器设备 ５􀆰３􀆰１　显微红外成像系统 配有光源、分光系统、检测器、样品台、测量附件和配套的数据处理软件等.波数范围应包括 ８００cm－１~２０００cm－１. ５􀆰３􀆰２　压片机 配有压片模具、压力表、加压系统和保护装置等.可将饲料粉末压成表面平整光滑且不易损坏的 压片. ５􀆰４　样品 按GB/T２０１９５的规定制备试样,至少２００g,粉碎使其全部过０􀆰４２５mm试验筛,混合均匀,装入密 闭容器中,备用. ５􀆰５　试验步骤 ５􀆰５􀆰１　试样压片制备 平行做两份试验.取适量试样,用压片机在一定压力及压制时间制备试样压片,所用试样质量、压力 和压制时间的确定应确保压片表面平整且在分析过程中不易破损. 应检查试样压片表面平整度,不应出现凹陷、突起、裂痕等影响红外光谱采集的物理缺陷. 在试样压片制备过程中,应保持压片模具的清洁,不应出现样品污染.试样压片在制备及分析过程中 不应触摸,以防污染样品. 阳性对照样品(５􀆰２􀆰１)和阴性对照样品(５􀆰２􀆰２)同步制备. ５􀆰５􀆰２　显微红外光谱采集 显微红外光谱采集参考条件如下: a)　光谱分辨率为８cm－１; b)空间分辨率为２５μm×２５μm; c)采集不低于２万条显微红外光谱. ５􀆰５􀆰３　显微红外光谱预处理 用主成分降噪方法提高显微红外光谱的信噪比,对光谱进行二阶导数处理.若使用的显微红外成像 系统的波数范围包含CO２在２３４９cm－１附近的吸收信号,应剔除. ５􀆰５􀆰４　抗生素滤渣参比光谱获取 抗生素滤渣参比光谱的获取按附录A中A􀆰１的规定执行. ５􀆰５􀆰５　余弦相似度计算 试样显微红外光谱与抗生素滤渣参比光谱的余弦相似度以S计,按公式(１)计算. S＝A􀅰B |A|􀅰|B|(１) 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 式中: A———试样的显微红外光谱; B———抗生素滤渣的参比光谱. ５􀆰６　质量控制 符合以下条件检测结果成立,否则应重新检测: a)　阴性对照:无相似度高于或等于阈值(阈值的确定按A􀆰２的规定执行)的光谱检出; b)阳性对照:有相似度高于或等于阈值的光谱检出,且与添加的目标抗生素滤渣一致; c)两份平行检测样品结果一致. ２NY/T４８４０—２０２５ ５􀆰７　结果判定 在符合５􀆰６的情况下,若余弦相似度大于或等于阈值,则判定为含有抗生素滤渣的阳性样品.根据余 弦相似度列出含有抗生素滤渣的种类.若余弦相似度低于阈值,则判定为阴性样品. ６　液相色谱高分辨质谱法 ６􀆰１　原理 试样经提取后,液相色谱高分辨质谱仪检测,用抗生素滤渣的特征标志物和特征质谱信息进行鉴别. ６􀆰２　试剂或材料 除非另有规定,仅使用分析纯试剂. ６􀆰２􀆰１　水:GB/T６６８２,一级. ６􀆰２􀆰２　甲酸:色谱纯. ６􀆰２􀆰３　甲醇:色谱纯. ６􀆰２􀆰４　乙腈:色谱纯. ６􀆰２􀆰５　０􀆰１％甲酸溶液:移取１mL甲酸(６􀆰２􀆰２),用水稀释至１０００mL,混匀. ６􀆰２􀆰６　０􀆰５％乙二胺四乙酸溶液:称取５g乙二胺四乙酸,用水溶解并稀释至１０００mL,混匀. ６􀆰２􀆰７　试样提取溶液:移取５０mL０􀆰５％乙二胺四乙酸溶液(６􀆰２􀆰６),加入７５０mL乙腈、１００mL甲醇、 １００mL二甲基亚砜,混匀. ６􀆰２􀆰８　抗生素滤渣特征标志物的标准品:如相关的特征能获得,应收集相关名称、分子量、配制溶剂等信 息,可以获得相关信息的标准品见附录B. ６􀆰２􀆰９　标准储备溶液(１mg/mL):准确称取适量标准品(以有效成分计,精确至０􀆰０１mg),采用附录B中 对应溶剂配制. ６􀆰２􀆰１０　标准工作溶液(１０μg/mL):准确移取标准储备溶液(６􀆰２􀆰９)０􀆰１mL,用提取溶液稀释并定容至 １０mL,混匀.－１８℃以下避光保存,有效期７d. ６􀆰２􀆰１１　微孔滤膜:０􀆰２２μm,有机系. ６􀆰２􀆰１２　阳性对照样品:在阴性对照样品加入至少含有５％(质量分数)目标抗生素滤渣,混合均匀,制成 阳性对照样品. ６􀆰２􀆰１３　阴性对照样品:不含抗生素滤渣的饲料样品. ６􀆰３　仪器设备 ６􀆰３􀆰１　液相色谱高分辨质谱仪:一级分辨率不小于２００００[以利血平m/z＝６０９􀆰２８０７为基准,按半峰 宽(FWHM)计],质量准确性相对偏差不大于５×１０－６(partspermillion,m/z＝６０９􀆰２８０７);二级分辨率 不小于１００００. ６􀆰３􀆰２　分析天平:精度为０􀆰１mg和０􀆰０１mg. ６􀆰３􀆰３　离心机:转速不低于８０００r/min. ６􀆰３􀆰４　超声波清洗仪. ６􀆰４　样品 按照GB/T２０１９５规定制备试样,至少２００g,粉碎使其全部过０􀆰４２５mm试验筛,充分混匀.装入密 闭容器中,备用.选取类型相同,均匀一致且在待测物保留时间处,仪器响应值小于方法定量限３０％的饲 料样品,作为空白样品. ６􀆰５　试验步骤 ６􀆰５􀆰１　提取 平行做两份试验.称取试样５g(精确至０􀆰１mg),置于５０mL离心管中,加入２０mL试样提取溶液 (６􀆰２􀆰７),超声提取３０min,每１０min振摇一次,８０００r/min离心５min,取上清液,用０􀆰２２μm滤膜 ３NY/T４８４０