2 0 2 5 1 2 0 9 发 布 － － 2 0 2 6 0 5 0 1 － － 实 施 大 口 黑 鲈 蛙 病 毒 检 测 方 法 5 0 中 华 人 民 共 和 国 水 产 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 0 2 0 . 3 0 C C S B 7 2 4 9 — 2 0 2 5 D e t e c t i o n m e t h o d s f o r l a r g e m o u t h b a s s r a n a v i r u s S C ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布SC/T７２４９—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部渔业渔政管理局提出. 本文件由全国水产标准化技术委员会水产养殖病害防治分技术委员会(SAC/TC１５６/SC１１)归口. 本文件起草单位:浙江省淡水水产研究所、全国水产技术推广总站、华东理工大学、中国检验检疫科学 研究院、浙江省水产技术推广总站. 本文件主要起草人:潘晓艺、蔺凌云、张翔、陈静、蔡晨旭、沈锦玉、王启要、王娜、姚嘉赟、朱凝瑜、袁雪梅、 黄雷、彭先启、步夏莲、黄小红、尹文林、梁倩蓉. ⅠSC/T７２４９—２０２５ 　 　 　大口黑鲈蛙病毒检测方法 １　范围 本文件描述了大口黑鲈蛙病毒检测的试剂和材料、仪器设备、主要临床症状、样品、病毒分离、套式 PCR检测、qPCR检测及综合判定的方法. 本文件适用于大口黑鲈蛙病毒的检测,及其引起相关疾病的流行病学调查、检疫和监测. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T１８０８８　出入境动物检疫采样 SC/T７０１１􀆰１　水生动物疾病术语与命名规则　第１部分:水生动物疾病术语 SC/T７０１１􀆰２　水生动物疾病术语与命名规则　第２部分:水生动物疾病命名规则 SC/T７０１６􀆰１　鱼类细胞系　第１部分:胖头鱼岁肌肉细胞系(FHM) SC/T７０１６􀆰５　鱼类细胞系　第５部分:鲤上皮瘤细胞系(EPC) SC/T７１０３　水生动物产地检疫采样技术规范 ３　术语和定义 SC/T７０１１􀆰１和SC/T７０１１􀆰２界定的术语和定义适用于本文件. ４　缩略语 下列缩略语适用于本文件. BHQ:黑洞淬灭剂(blackholequencher) bp:碱基对(basepair) CPE:细胞病变效应(cytopathiceffect) Ct:阈值循环数(cycleＧthreshold) DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid) dNTPs:脱氧核糖核苷三磷酸混合物(deoxyＧribonucleosidetriphosphatemixture) EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid) EPC:鲤上皮瘤细胞系(epitheliomapapulosumcyprinicellline) FHM:胖头鱼岁肌肉细胞系(fatheadminnowmusclecellline) LMBV:大口黑鲈蛙病毒(largemouthbassranavirus) M１９９:培养液１９９(medium１９９) PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction) qPCR:实时荧光定量PCR(quantitativerealＧtimePCR) SDS:十二烷基硫酸钠(sodiumdodecylsulfate) Taq:水生栖热菌(Thermusaquaticus) TE:Tris盐酸和EDTA(Tris􀅰HClＧEDTA) Tris:三羟甲基氨基甲烷(trishydroxymethylaminomethane) ６ＧFAM:６Ｇ羧基荧光素(６Ｇfluoresceinamidite) １SC/T７２４９—２０２５ ５　试剂和材料 除非另有说明,在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水. ５􀆰１　Tris饱和酚(pH≥７􀆰８). ５􀆰２　无水乙醇. ５􀆰３　TaqDNA聚合酶(５U/μL):商品化试剂,－２０℃保存. ５􀆰４　HotＧStartTaqDNA聚合酶(５U/μL):商品化试剂,－２０℃保存. ５􀆰５　dNTPs(各２􀆰５mmol/L):商品化试剂,－２０℃保存. ５􀆰６　１０×PCR缓冲液(无Mg２＋):商品化试剂,－２０℃保存. ５􀆰７　MgCl２(２５mmol/L):商品化试剂,－２０℃保存. ５􀆰８　DNAMarker:相对分子质量大小在１００bp~２０００bp范围,商品化试剂,－２０℃保存. ５􀆰９　６×载样缓冲液:商品化试剂,４℃保存. ５􀆰１０　核酸染料:商品化试剂,４℃保存. ５􀆰１１　鲤上皮瘤细胞系(EPC):符合SC/T７０１６􀆰５的规定. ５􀆰１２　胖头鱼岁肌肉细胞系(FHM):符合SC/T７０１６􀆰１的规定. ５􀆰１３　孵育液:含有１０００IU/mL青霉素和１０００μg/mL链霉素的M１９９培养液,４℃保存. ５􀆰１４　维持液:含有２％新生牛血清的M１９９培养液,４℃保存. ５􀆰１５　酚/氯仿/异戊醇混合液:将Tris饱和酚、氯仿、异戊醇按体积比２５∶２４∶１混匀,４℃保存. ５􀆰１６　氯仿/异戊醇混合液:将氯仿、异戊醇按体积比２４∶１混匀,４℃保存. ５􀆰１７　TE缓冲液:按附录A中A􀆰１的要求配制. ５􀆰１８　抽提缓冲液:按A􀆰２的要求配制. ５􀆰１９　蛋白酶K:按A􀆰３的要求配制. ５􀆰２０　１０mol/L乙酸铵:按A􀆰４的要求配制. ５􀆰２１　５０×电泳缓冲液:按A􀆰５的要求配制. ５􀆰２２　１×电泳缓冲液:按A􀆰６的要求配制. ５􀆰２３　套式PCR引物:１０μmol/L,－２０℃保存.其中,第一步PCR引物F１和R１,扩增９６７bp片段;第 二步PCR引物F２和R２,扩增４７５bp片段(见附录B),引物序列如下: 引物F１:５′ＧTCTCGCCACTTATGACAGCCTTＧ３′; 引物R１:５′ＧGGGCTCCAGGACGGTGTTACＧ３′; 引物F２:５′ＧTATGTGCTCAACTCTTGGCTGGTCＧ３′; 引物R２:５′ＧCCACGATKGGCTTGACTTCTCCＧ３′,K为简并碱基(K:G/T). ５􀆰２４　qPCR引物:１０μmol/L,－２０℃保存.扩增引物分别为LMBVq１０２F和LMBVq１０２R,探针为 LMBVqTP,扩增LMBVMCP基因中的１０２bp片段(见附录B),引物探针序列如下: LMBVq１０２F:５′ＧACTGGCCACCACCTCTACTCＧ３′; LMBVq１０２R:５′ＧAGACACGTTGATGCTTGCGTＧ３′; LMBVqTP:６ＧFAMＧACGCCCTGAGCCTCAACGATCCＧBHQ１. ５􀆰２５　阳性对照:感染LMBV的细胞悬液或组织匀浆液,－８０℃保存. ５􀆰２６　阴性对照:未感染LMBV的细胞悬液或组织匀浆液,－８０℃保存. ５􀆰２７　空白对照:蒸馏水. ６　仪器设备 ６􀆰１　组织研磨器. ２SC/T７２４９—２０２５ ６􀆰２　生物安全柜. ６􀆰３　生化培养箱. ６􀆰４　倒置显微镜. ６􀆰５　高速冷冻离心机:最高离心力在１２０００g以上. ６􀆰６　水浴锅或金属浴. ６􀆰７　涡旋振荡器. ６􀆰８　普通冰箱. ６􀆰９　超低温冰箱. ６􀆰１０　PCR仪. ６􀆰１１　实时荧光定量PCR仪:具有FAM荧光检测通道. ６􀆰１２　电泳仪. ６􀆰１３　平电泳槽. ６􀆰１４　紫外观察仪或凝胶成像仪:波长范围２８０nm~３２０nm. ６􀆰１５　电炉或微波炉. ６􀆰１６　微量移液器. ７　主要临床症状 不同养殖期病鱼症状:仔鱼期腹鳍基部出血,尾柄出血或烂尾(见附录C中图C􀆰１);稚鱼期体表大量 斑点状溃疡灶,头部或鳃颊红肿出血、溃烂(见图C􀆰２);幼鱼期和成鱼期体表出血、肌肉溃疡(见图C􀆰３). ８　样品 ８􀆰１　采样对象 大口黑鲈(Micropterussalmoides)、鳜(Sinipercachuatsi)、乌鳢(Channaargus)、花鲈(Lateolabrax maculatus)、太阳鱼(Lepomisgibbosus)等易感宿主. ８􀆰２　采样部位 体表用清水冲洗,再用７５％乙醇擦拭后,体长≤２cm的鱼,去眼去尾去除卵黄囊后取整条(尾)鱼; ２cm＜体长＜４cm的鱼,去头去尾后取整条(尾)鱼;４cm≤体长≤６cm的鱼,取内脏;体长＞６cm的鱼, 取肝、脾、肾和心.所取样品分别置于１􀆰５mL离心管中,宜立即执行第９章病毒分离,或/和进行DNA提 取操作.如不能立即进行病毒分离,应－８０℃保存备用. ８􀆰３　采样数量 出入境动物检疫采样按GB/T１８０８８的规定执行,其他采样按SC/T７１０３的规定执行. ８􀆰４　保存和运输 活鱼样品运送至实验室,及时取样;组织样品０℃~４℃低温状态运送至实验室;若运送时间超过２４ h,采用干冰进行运送. ９　病毒分离 ９􀆰１　样品处理 将样品置于孵育液(５􀆰１３)中使用组织研磨器(６􀆰１)匀浆,并按１∶１０的质量体积比稀释,组织稀释液 于(２５±１)℃下孵育