2 0 2 5 1 2 0 9 发 布 － － 2 0 2 6 0 5 0 1 － － 实 施 鳖 腮 腺 炎 病 诊 断 方 法 第 1 部 分 ： 中 华 鳖 出 血 综 合 征 病 毒 5 0 中 华 人 民 共 和 国 水 产 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 1 5 0 C C S B 7 2 5 0 . 1 — 2 0 2 5 D i a g n o s t i c m e t h o d s f o r T r i o n y x s i n e s i s m u m p s — P a r t 1 : T r i o n y x s i n e s i s h e m o r r h a g i c s y n d r o m e v i r u s S C ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布SC/T７２５０􀆰１—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 本文件是SC/T７２５０«鳖腮腺炎病诊断方法»的第１部分.SC/T７２５０已经发布了以下部分: ———第１部分:中华鳖出血综合征病毒; ———第２部分:中华鳖致病性蜡样芽孢杆菌. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部渔业渔政管理局提出. 本文件由全国水产标准化技术委员会水产养殖病害防治分技术委员会(SAC/TC１５６/SC１１)归口. 本文件起草单位:浙江省农业科学院、全国水产技术推广总站、浙江省淡水水产研究所、浙江省水产技 术推广总站. 本文件主要起草人:刘莉、吕孙建、余卫忠、张海琪、郭琦、沈卫锋、裴育、朱凝瑜、袁雪梅、何润真、楼宝、 姚嘉赟. ⅠSC/T７２５０􀆰１—２０２５ 引　　言 鳖腮腺炎是近年来对鳖危害较大的一类疾病,能够引起鳖暴发性死亡.鳖腮腺炎包括细菌性腮腺炎 和病毒性腮腺炎,两者症状相似而病原不同.目前鳖腮腺炎主要根据临床症状观察进行判断.因此编制 两种鳖腮腺炎的诊断方法将用于准确诊断两种病原引起的鳖腮腺炎,为鳖病害防控提供依据.本文件拟 由以下部分组成,本文件为第１部分.具体如下: ———第１部分:中华鳖出血综合征病毒.目的在于描述中华鳖出血综合征病毒引起的鳖腮腺炎的 诊断. ———第２部分:中华鳖致病性蜡样芽孢杆菌.目的在于描述中华鳖致病性蜡样芽孢杆菌引起的鳖腮 腺炎的诊断. ⅡSC/T７２５０􀆰１—２０２５ 　 　 　鳖腮腺炎病诊断方法 第１部分:中华鳖出血综合征病毒 １　范围 本文件描述了中华鳖出血综合征病毒引起的鳖腮腺炎诊断的试剂和材料、仪器设备、临床症状、样品、 套式RTＧPCR检测、实时荧光RTＧPCR检测及综合判定的方法. 本文件适用于由中华鳖出血综合征病毒引起的鳖腮腺炎诊断和流行病学调查. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 SC/T７０１１􀆰１　水生动物疾病术语与命名规则　第１部分:水生动物疾病术语 SC/T７０１１􀆰２　水生动物疾病术语和命名规则　第２部分:水生动物疾病命名规则 ３　术语和定义 SC/T７０１１􀆰１和SC/T７０１１􀆰２界定的术语和定义适用于本文件. ４　缩略语 下列缩略语适用于本文件. bp:碱基对(basepair) Ct:循环数阈值(cyclethreshold) cDNA:互补DNA(complementaryDNA) DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid) DEPC:焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate) dNTPs:脱氧核糖核苷三磷酸混合物(deoxyribonucleosidetriphosphatemixture) EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid) FAM:６Ｇ羧基荧光素(６Ｇcarboxyfluorescein) MＧMLV:莫洛尼鼠白血病病毒(Moloneymurineleukemiavirus) nt:核苷酸(nucleotide) Oligo(dT)１５:１５个胸腺嘧啶组成的寡聚核苷酸 PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction) RNA:核糖核酸(ribonucleicacid) RTＧPCR:逆转录PCR(reversetranscriptionPCR) Taq:水生栖热菌(Thermusaquaticus) TSHSV:中华鳖出血综合征病毒(Trionyxsinensishemorrhagicsyndromevirus) ５　试剂和材料 本文件中所有化学试剂,除非另有规定,仅使用分析纯试剂;水为符合GB/T６６８２中规定的一级水. ５􀆰１　琼脂糖:电泳级,室温保存. ５􀆰２　核酸染料:４℃保存. １SC/T７２５０􀆰１—２０２５ ５􀆰３　６×载样缓冲液:４℃保存. ５􀆰４　异丙醇(C３H８O):室温保存. ５􀆰５　氯仿(CHCl３):室温保存. ５􀆰６　dNTPs(各２􀆰５mmol/L):－２０℃保存. ５􀆰７　dNTPs(各１０mmol/L):－２０℃保存. ５􀆰８　DNAmarker:分子量大小范围１００bp~２０００bp,－２０℃保存. ５􀆰９　５×MＧMLV逆转录酶缓冲液:－２０℃保存. ５􀆰１０　MＧMLV逆转录酶(２００U/μL):－２０℃保存. ５􀆰１１　氯化镁(MgCl２,２５mmol/L):－２０℃保存. ５􀆰１２　Oligo(dT)１５(５０mmol/L):－２０℃保存. ５􀆰１３　RNA酶抑制剂(４０U/μL):－２０℃保存. ５􀆰１４　Trizol试剂:４℃保存. ５􀆰１５　HotＧStartTaqDNA聚合酶(５U/μL):－２０℃保存. ５􀆰１６　１０×PCR缓冲液(无Mg２＋):－２０℃保存. ５􀆰１７　７５％乙醇(C２H５OH):按附录A中A􀆰１配制. ５􀆰１８　EDTA(０􀆰５mol/L,pH８􀆰０):按A􀆰２配制. ５􀆰１９　５０×TAE电泳缓冲液:按A􀆰３配制. ５􀆰２０　１×TAE电泳缓冲液:按A􀆰４配制. ５􀆰２１　套式PCR引物:浓度为１０μmol/L,－２０℃保存.其中,外侧引物TSHSVＧhp２ＧF１和TSHSVＧhp２Ｇ R１,扩增５２８bp片段;内侧引物TSHSVＧhp２ＧF２和TSHSVＧhp２ＧR２,扩增２３１bp片段(见附录B).引物 序列如下: TSHSVＧhp２ＧF１:５′ＧACCAGGATCATGGCCCACCTACＧ３′; TSHSVＧhp２ＧR１:５′ＧTTCTTGGCAACATCGGCTTTCTＧ３′; TSHSVＧhp２ＧF２:５′ＧGGGGACTGCTGGAACTCTATTAＧ３′; TSHSVＧhp２ＧR２:５′ＧGTTTGGACCAGAAAGGTGAATGＧ３′. ５􀆰２２　探针法实时荧光RTＧPCR引物:浓度为１０μmol/L,－２０℃保存.扩增引物TSHSVqhp７F和 TSHSVqhp７R,探针TSHSVＧqTP,扩增TSHSVHP７基因中２００bp片段(见附录B).引物序列如下: TSHSVqhp７F:５′ＧTGGCTACTGTGCACGGCAATＧ３′; TSHSVqhp７R:５′ＧACCTCTTCAAAGTCACTCCATTGTAGGＧ３′; TSHSVＧqTP:５′Ｇ６FAMＧACACTGCTCCTCCTCCCACCAAGCCCAＧ６TAMRAＧ３′. ５􀆰２３　阳性对照:感染TSHSV的鳖组织样品,或阳性核酸,－８０℃保存. ５􀆰２４　阴性对照:未感染TSHSV的鳖组织样品,或阴性核酸,－８０℃保存. ５􀆰２５　空白对照:灭菌双蒸水. ６　仪器设备 ６􀆰１　组织研磨仪:研磨珠采用直径２mm的钢珠或陶瓷珠. ６􀆰２　超低温冰箱:－８０℃. ６􀆰３　高速冷冻离心机:４℃,离心力１２０００g以上. ６􀆰４　PCR仪. ６􀆰５　水平电泳仪. ６􀆰６　水平电泳槽. ６􀆰７　　紫外观察仪或凝胶成像仪:波长范围２８０nm~３２０nm. ２SC/T７２５０􀆰１—２０２５ ６􀆰８　水浴锅或金属浴. ６􀆰９　荧光定量PCR仪:具有FAM荧光检测通道. ７　临床症状 病鳖呼吸困难,头颈伸出,软弱无力,症状见图C􀆰１,严重时口鼻出血;剖检可见咽喉部黏膜充血,肠 道、肝脏、肾脏和脾脏等内脏器官出血严重,肝脏常因淤血出现花肝症状,见图C􀆰２. ８　样品 ８􀆰１　采样对象 稚鳖、幼鳖及成鳖. ８􀆰２　采样部位 稚鳖取全部内脏;幼鳖和成鳖优先采集肺组织,其次是脾脏、肾脏. ８􀆰３　采样数量 具有临床症状的幼鳖或成鳖采３只~５只;稚鳖或无临床症状的幼鳖采８只~１０只;无临床症状的成 鳖采５只~８只. ８􀆰４　保存和运输 鳖样品运送至实验室,及时取样;组织样品４℃以下低温状态运送至实验室;若运送时间超过２４h,采 用干冰低温运输. ９　套式RTＧPCR检测 ９􀆰１　样品处理 样品用组织研磨仪(６􀆰１)匀浆后,立即用于检测或保存于－８０℃超低温冰箱(６􀆰２)备用. ９􀆰２　RNA提取 ９􀆰２􀆰１　取３０mg~５０mg组织匀浆置于１􀆰５mL无RNA酶离心管中,加入１mLTrizol(５􀆰１４)试剂,充分 混合后,室温放置５min.