2 0 2 5 1 2 0 9 发 布 － － 2 0 2 6 0 5 0 1 － － 实 施 鳖 腮 腺 炎 病 诊 断 方 法 第 2 部 分 ： 中 华 鳖 致 病 性 蜡 样 芽 孢 杆 菌 5 0 中 华 人 民 共 和 国 水 产 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 1 5 0 C C S B 7 2 5 0 . 2 — 2 0 2 5 D i a g n o s t i c m e t h o d s f o r T r i o n y x s i n e s i s m u m p s — P a r t 2 : T r i o n y x s i n e s i s p a t h o g e n i c B a c i l l u s c e r e u s S C ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布SC/T７２５０􀆰２—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 本文件是SC/T７２５０«鳖腮腺炎病诊断方法»的第２部分.SC/T７２５０已经发布了以下部分: ———第１部分:中华鳖出血综合征病毒; ———第２部分:中华鳖致病性蜡样芽孢杆菌. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部渔业渔政管理局提出. 本文件由全国水产标准化技术委员会水产养殖病害防治分技术委员会(SAC/TC１５６/SC１１)归口. 本文件起草单位:浙江省淡水水产研究所、浙江省农业科学院、全国水产技术推广总站、安徽省农业科 学院. 本文件主要起草人:张海琪、刘莉、姚嘉赟、袁雪梅、陈静、吕孙建、林锋、焦锦彪、蒋业林、蔡晨旭、王根连、 陈祝、楼宝、郭琦. ⅠSC/T７２５０􀆰２—２０２５ 引　　言 鳖腮腺炎是近年来对鳖危害较大的一类疾病,能够引起鳖暴发性死亡.鳖腮腺炎包括细菌性腮腺炎 和病毒性腮腺炎,两者症状相似而病原不同.目前鳖腮腺炎主要根据临床症状观察进行判断.因此编制 两种鳖腮腺炎的诊断方法将用于准确诊断两种病原引起的鳖腮腺炎,为鳖病害防控提供依据.本文件拟 由以下部分组成,本文件为第２部分.具体如下: ———第１部分:中华鳖出血综合征病毒.目的在于描述中华鳖出血综合征病毒引起的鳖腮腺炎的 诊断. ———第２部分:中华鳖致病性蜡样芽孢杆菌.目的在于描述中华鳖致病性蜡样芽孢杆菌引起的鳖腮 腺炎的诊断. ⅡSC/T７２５０􀆰２—２０２５ 　 　 　鳖腮腺炎诊断方法 第２部分:中华鳖致病性蜡样芽孢杆菌 １　范围 本文件描述了中华鳖致病性蜡样芽孢杆菌引起的鳖腮腺炎诊断的试剂和材料、仪器设备、临床症状、 样品、组织病理检查、生理生化鉴定、PCR检测及综合判定的方法. 本文件适用于由中华鳖致病性蜡样芽孢杆菌引起的鳖腮腺炎的诊断和流行病学调查. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T１８０８８　出入境动物检疫采样 GB/T１８６５２　致病性嗜水气单胞菌检验方法 GB/T２８６３０􀆰４　白斑综合征(WSD)诊断规程　第４部分:组织病理学诊断法 SC/T７０１１􀆰１　水生动物疾病术语与命名规则　第１部分:水生动物疾病术语 SC/T７０１１􀆰２　水生动物疾病术语与命名规则　第２部分:水生动物疾病命名规则 SC/T７１０３　水生动物产地检疫采样技术规范 ３　术语与定义 SC/T７０１１􀆰１和SC/T７０１１􀆰２界定的术语和定义适用于本文件. ４　缩略语 下列缩略语适用于本文件. bp:碱基对(basepair) DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid) dNTPs:脱氧核苷三磷酸混合物(deoxyribonucleotidetriphosphatemixture) EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid) PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction) TaqDNA聚合酶:水生栖热菌DNA聚合酶(ThermusaquaticusDNApolymerase) TSA:胰酪大豆胨琼脂(trypticsoyagar) TSB:胰酪大豆胨肉汤(trypticsoybroth) SDS:十二烷基硫酸钠(sodiumdodecylsulfate) ５　试剂和材料 除非另有说明,在分析中仅使用确认为分析纯的试剂,使用的水为蒸馏水、无菌水、去离子水或相当纯 度的水. ５􀆰１　琼脂糖:电泳级,常温保存. ５􀆰２　电泳核酸染料:溴化乙锭或其他等效试剂,－２０℃保存. ５􀆰３　氯仿/异戊醇混合液:将氯仿(CHCl３)和异戊醇(C５H１２O)按体积比２４∶１混匀,４℃避光保存. ５􀆰４　酚/氯仿/异戊醇混合液:将Tris饱和酚(C６H６O)、氯仿(CHCl３)和异戊醇(C５H１２O)按体积比２５∶ ２４∶１混匀,４℃避光保存. １SC/T７２５０􀆰２—２０２５ ５􀆰５　异丙醇(C３H８O):常温保存. ５􀆰６　DNA分子质量标准溶液:１０００bp~２０００bp,－２０℃保存. ５􀆰７　MgCl２(２５mmol/L):常温保存. ５􀆰８　NaCl(５mol/L):常温保存. ５􀆰９　蛋白酶K(C２９H２７N２O１２P)(２０mg/mL):－２０℃保存. ５􀆰１０　RNaseA(５０(g/mL):－２０℃保存. ５􀆰１１　dNTPs(２􀆰５mmol/L):含dATP、dTTP、dGTP和dCTP各２􀆰５mmol/L的混合物,－２０℃保存. ５􀆰１２　TaqDNA聚合酶(５U/μL):－２０(C保存. ５􀆰１３　１０×PCR缓冲液(不含Mg２＋):随TaqDNA聚合酶提供,－２０℃保存. ５􀆰１４　６×载样缓冲液:常温保存. ５􀆰１５　TSA培养基:按了附录A的A􀆰１配制. ５􀆰１６　TSB培养基:按A􀆰２配制. ５􀆰１７　石碳酸复红染色液:按A􀆰３配制. ５􀆰１８　吕氏碱性美蓝染液:按A􀆰４配制. ５􀆰１９　９５％乙醇(C２H６O):按A􀆰５配制. ５􀆰２０　７５％乙醇(C２H６O):按A􀆰６配制. ５􀆰２１　７０％乙醇(C２H６O):按A􀆰７配制. ５􀆰２２　１×TAE电泳缓冲液:按A􀆰８配制. ５􀆰２３　CTAB/NaCl:按A􀆰９配制. ５􀆰２４　TE缓冲液:按A􀆰１０配制. ５􀆰２５　１０％SDS:按A􀆰１１配制. ５􀆰２６　引物HPBcＧF(１０μmol/L):５′ＧCTACAGGTCGCAGATAAAACAGTCＧ３′; 引物HPBcＧR(１０μmol/L):５′ＧGCAAGGGCTAAAAATGAAATCTＧ３′. ５􀆰２７　阳性对照:感染中华鳖致病性蜡样芽孢杆菌的鳖组织、中华鳖致病性蜡样芽孢杆菌培养物或含目的 片段的质粒DNA. ５􀆰２８　阴性对照:未感染中华鳖致病性蜡样芽孢杆菌的鳖组织、其他革兰氏阳性菌培养物. ５􀆰２９　空白对照:无菌水. ６　仪器设备 ６􀆰１　恒温培养箱. ６􀆰２　切片机. ６􀆰３　组织脱水机. ６􀆰４　包埋机. ６􀆰５　染色机. ６􀆰６　展片水浴锅. ６􀆰７　平板烘片机. ６􀆰８　封片机. ６􀆰９　水平电泳仪. ６􀆰１０　普通PCR仪. ６􀆰１１　摇床. ６􀆰１２　紫外观察仪或凝胶成像仪:波长范围２８０nm~３２０nm. ２SC/T７２５０􀆰２—２０２５ ６􀆰１３　生物安全柜. ６􀆰１４　光学显微镜. ６􀆰１５　高速冷冻离心机:转速１２０００r/min以上. ６􀆰１６　微量移液器:量程为０􀆰１μL~１０μL、１０μL~１００μL和１００μL~１０００μL. ７　临床症状 见附录B. ８　样品 ８􀆰１　采样对象 稚鳖、幼鳖或成鳖. ８􀆰２　采样部位 无菌采集肺脏、脾脏、肝脏、肾脏和肠道组织样品. ８􀆰３　采样数量 出入境动物检疫采样按GB/T１８０８８的规定执行,其他采样按SC/T７１０３的规定执行. ８􀆰４　保存和运输 用于组织病理检查的鳖样应活体送达实验室,及时取样检测;不用于组织病理检查的鳖样,应活体或 冰鲜２４h内送达实验室.采样应加贴标签,标签上清楚标明样品编号、采样时间、采样地点. ９　组织病理检查 ９􀆰１　样品处理和观察 将纱布浸７５％乙醇(５􀆰２０)后,覆盖于病鳖表面,或用含７０％乙醇(５􀆰２１)的棉球擦拭,打开鳖背壳, 观察鳖咽喉及内脏;取肝脏、脾脏、肾脏和肠道组织,迅速切成厚度不超过３mm的组织块,按GB/T ２８６３０􀆰４的方法进行组织固定、脱水、石蜡包埋、切片、苏木精染色和伊红染色、封片,并置于光学显微 镜下观察. 鳖细菌性腮腺炎解剖学特征见B􀆰４,组织病理特征见B􀆰５. ９􀆰２　结果判定 若观察到肝脏、脾脏、肠道均发现细胞核着色较浅有明显空洞甚至破损,即细胞核坏死,大量细菌在肝 脏和脾脏中聚集,则判定为具有组织病理学特征. １０　生理生化鉴定 １０􀆰１　病原菌分离 用接种环或接种针(无菌)蘸取鳖的不同组织部位,分别划线接种于TSA培养基(５􀆰１５)上,倒置于恒 温培养箱３０℃±１℃培养８h~１２h. １０􀆰２　菌落的选取和纯化培养 TSA培养基上可见圆形乳白色凸起,融蜡状,表面光滑,边缘清晰整齐的菌落(见B􀆰６).挑取单菌落 接种到TSB培养基(５􀆰１６)中,并在３０℃±１℃、２００r/min的摇床中培养１２h.