ICS 65.020.99 CCS B 65 DB 63 青海省 地方标准 DB63/T 2538—2026 普氏原羚个体识别分子技术规程 2026 - 05 - 07发布 2026 - 07 - 01实施 青海省市场监督管理局 发布 DB63/T 2538—2026 II 前言 本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第 1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由青海省林业和草原标准化技术委员会提出。 本文件由青海省林业和草原 局归口。 本文件起草单位：中国科学院西北高原生物研究所、青海省国家公园科研监测评估中心 。 本文件主要起草人：蔡振媛、张同作、高红梅、宋晓英、丁旭洁、 严琳、欧智布、胡天石、宋鹏飞、 姚占山、江峰、顾海峰、李斌、梁程博、张萌、郭凡、陈晓苑、王佳能 。 本文件由青海省林业和草原局监督实施。 DB63/T 2538—2026 1 普氏原羚个体识别分子技术规程 1 范围 本文件规定了普氏原羚 个体识别分子技术的 术语和定义 、缩略语、 主要仪器设备及试剂、 溶液配方 、 操作程序等技术 要求。 本文件适用于普氏原羚个体识别。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 43650 野生动物及其制品 DNA物种鉴定技术规程 SF/T 0134 法医学生物检材核酸提取技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 DNA样品 利用普氏原羚带毛囊的毛发、皮张、血液、肌肉等组织或新鲜粪便等样本提取的基因组 DNA样品。 微卫星标记 普氏原羚的多个特定的基本重复单元为 4碱基的微卫星序列， 其多态性用于普氏原羚个体识别。 微卫星基因分型 对DNA样品进行微卫星位点 PCR扩增后，利用毛细管电泳技术测定 生物样本 基因型。 个体识别 采用微卫星标记技术， 对同一时间或不同时间，某一区域或多个区域的两个或多个DNA 样品是否 来源于同一个体 进行判定 。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DNA：脱氧核糖核酸（D eoxyribonucleic Acid） dNTPs：脱氧核糖核苷三磷酸（Deoxy- ribonucleoside Triphosphates ） DTT：二硫苏糖醇（ Dithiothreitol） EDTA：乙二胺四乙酸（ Ethylenediaminetetraacetic Acid ） DB63/T 2538—2026 2 OD：光密度（Optical Density） PBS：磷酸盐缓冲溶液（ Phosphate Buffered Saline） PCR：聚合酶链式反应（P olymerase Chain Reaction） SDS：十二烷基磺酸钠（ Sodium Dodecyl Sulfonate ） Taq酶：耐热DNA聚合酶（ Taq-DNA Polymerase ） TE：含乙二胺四乙酸的三羟甲基氨基甲烷缓冲液（ Tris-EDTA Buffer Solution） Tris：三（羟甲基 ）氨基甲烷 （Tris(hydroxymethyl)aminomethane ） 5 主要仪器设备及试剂 主要仪器设备及试剂 见附录 A，除非另有说明， 所用试剂均为分析纯。 超纯水和纯水 满足 GB/T 6682 要求。 6 溶液配方 见附录 B。 7 操作程序 取样与储存 取样与储存样本 按照 GB/T 43650执行。 DNA样品提取与检测 根据检测样 本类型，基因组 DNA提取按照 SF/T 0134执行或选择对应的商 用试剂盒。使用微量分光 光度计对每个 DNA样品进行质量检测， OD260/OD280 值在1.7～2.1之间，且浓度＞2.0 ng/μL的DNA样品 判定为合格。 DNA样品保存 一个月内使用的 DNA样品保存于4℃冰箱，长期保存的 DNA样品保存于 -80℃超低温冰箱。 微卫星标记 宜选取附录 C中PR -6、PR-14、PR-25、PR-30、 PR-40、PR-65和PR -71等7个，或者任意 9个微卫星标 记进行普氏原羚个体识别。 微卫星标记 PCR 7.5.1 微卫星标记引物合成与荧光标记 根据附录C 的微卫星标记的引物序列合成引物，并对正向引物的5’ 端进行荧光标记。 操作过程应避 光。 7.5.2 PCR体系 选用PCR T aq酶进行微卫星扩增，反应体系见附录D ，表 D.1。 DB63/T 2538—2026 3 7.5.3 PCR程序 DNA样品的微卫星位点扩增在 PCR仪上进行， PCR程序为： 95℃预变性 5 min；94℃变性 30 s，最适 退火温度退火30 s，72℃延伸 30 s，设置 10个循环反应； 94℃变性 30 s，55℃退火30 s ，72℃延伸 30 s，设 置35个循环反应； 72℃修复延伸 8 min。 7.5.4 PCR最适退火温度 12对微卫星引物 最适退火温度见附录D ，表 D.2。 PCR产物检测 PCR扩增完成后， 用1.8%琼脂糖凝胶电泳进行检测，电泳方法见 附录 E。电泳条带 清晰、长度与附 录C相符，且无其他条带， 则扩增成功 ；将扩增成功的 PCR产物避光存放于 4℃冰箱，用于后续毛细管电 泳检测，进行基因分型。 微卫星基因分型 7.7.1 毛细管电泳检测 符合微卫星基因分型要求的PCR产物进行毛细管电泳检测，获取微卫星扩增长度检测 数值，四舍五 入取整得到微卫星扩增长度数值 。 7.7.2 电泳结果人工校对 获取的微卫星长度数值减去附录 C参考长度最小值 的差除以 4进行人工校正 ： a) 余数为0，该微卫星长度为有效基因型； b) 余数为1，该微卫星长度数值减 1后为有效基因型； c) 余数为2，重新进行微卫星标记 PCR和微卫星基因分型； d) 余数为3，该微卫星长度数值加 1后为有效基因型。 8 个体识别 对微卫星位点的分型数据进行个体识别判定： a) 当两个或两个以上的检测样品微卫星标记分型结果一致时，判定来自同一个体； b) 当两个样品的微卫星标记分型结果中只有 1个基因型差异时， 判定来自同一个体； c) 当两个样品的微卫星标记分型结果中有 2个及以上基因型结果不同时，判定来自不同个体。 DB63/T 2538—2026 4 附录 A （规范性） 主要仪器设备及试剂 A.1 主要仪器设备 冷冻研磨机、 -20 ℃冰箱、-80 ℃超低温冰箱 、高压灭菌锅 、超纯水仪 、电子天平、 水浴锅、移液器、 涡旋振荡器 、磁力搅拌器、 低温高速离心机、 微量分光光度计 、PCR扩增仪、微波炉、电泳仪、 水平电 泳系统、凝胶成像系统 、毛细管电泳系统。 A.2 主要试剂 Chelex -100溶液、蛋白酶K、DTT、SDS、细胞裂解缓冲液 （含有螯合剂 EDTA）、TNE缓冲液 、TES 裂解液、0.5 mol/L EDTA（pH10.0 ）、无水乙醇 、75%乙醇、次氯酸钠、 苯酚、氯仿、异戊醇、TE缓冲 液、3 mol/L NaCl溶液、吸附液 、硅珠悬液 （富含二氧化硅微粒 ）、漂洗液、SE缓冲液、5 mol/L NaCl 溶液、异丙醇、 50×TAE缓冲液、琼脂糖（纯度100% ）、6×电泳上样缓冲液（含有溴酚蓝） 、核酸染 料、 Taq酶、dNTP、50 bp～500 bp DNA marker 、PBS缓冲液。 DB63/T 2538—2026 5 附录 B （资料性） 溶液配方 B.1 细胞裂解缓冲液 0.64 mol/L 蔗糖， 0.01 mol/L MgC l2，0.02 mol/L Tris-HCl（pH7.6）， 2% TritonX -100。 B.2 TE缓冲液 10 mmol/L Tris -HCl（pH7.5），1 mmol/L EDTA（pH8.0）。 B.3 TNE缓冲液 10 mmol/L Tris -HCl（pH7.5），5 mmol/L EDTA（pH8.0）， 100 mol/L NaCl。 B.4 TES裂解液 10 m mol/L Tris -HCl（pH8.0），100 mmol/L NaCl，0.5 mmol/L EDTA（pH8.0），0.1% SDS。 B.5 吸附液 12 g GuSCN，10 mL 0.1 mol/L Tris-HCl（pH6.4）， 0.8 m L 0.5 mol/L EDTA，0.5 m L Triton X- 100。 B.6 漂洗液 12 g GuSCN，10 m L 0.1 mol/L Tris -HCl（pH6.4）。 B.7 SE缓冲液 25 mmol/L EDTA，75 mmol/L NaCl。 B.8 50×TAE缓冲液 Tris碱242