ICS67.180.10 CCSB47 中华人民共和国供销合作行业标准 GH/T1532—2026GH 蜂蜜中薰衣草源成分的检测 实时荧光PCR法 Identificationoflavanderderivedingredientsinhoney—real-timePCRmethod 2026-03-19发布 2026–07–01实施 中华全国供销合作总社  发布GH/T1532—2026 I前言 本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华全国供销合作总社提出。 本文件由全国蜂产品标准化技术委员会（SAC/TC601）归口。 本文件起草单位：中国计量大学、南京海关动植物与食品检测中心、中国蜂产品协会、杭州市生态 环境局临安分局、郑州师范学院、河南科技学院、中国质量检验检测科学研究院、山东蜜源蜂业有限公 司、北屯市新原养蜂农民专业合作社、伊犁伊阳蜂业有限公司。 本文件主要起草人：李红亮、文嘉琪、杨雪梅、王毅谦、吴帆、谭丽蕊、王宏、王林青、王国昌、 张紫娟、杨艳歌、苏昌鹏、安传远、周莲。GH/T1532—2026 1蜂蜜中薰衣草源成分的检测实时荧光PCR法 1范围 本文件规定了蜂蜜中薰衣草源成分的实时荧光PCR检测方法。 本文件适用于蜂蜜中薰衣草源成分的定性检测。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T27403-2018实验室质量控制规范食品分子生物学检 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 薰衣草lavender 薰衣草（LavandulaangustifoliaMill.），唇形花科、薰衣草属的多年生常绿小灌木。薰衣草普遍夏秋 季开花，为穗状花序，花序长5~15cm，花色因品种而异有蓝，淡紫，紫，浓紫及白色等，以蓝紫色最 普遍。 3.2 薰衣草源成分lavenderderivedingredients 是指含有薰衣草属（Lavandula）植物来源的物质，并保留其特征性核酸序列。 3.3 实时荧光PCRreal-timePCR 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程，实现对起始模 板的定量及定性分析。 3.4 循环阈值cyclethreshold 每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。GH/T1532—2026 2Ct：循环阈值(Cyclethreshold) CTAB：十六烷基三甲基溴化铵(Cetyltrimethylammoniumbromide) DNA：脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleicacid) EDTA：乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraaceticacid) FAM：羧基荧光素(Fluorescein5-carboxylicacid) ITS2：内转录间隔区2(Internaltranscribedspacer2) NADH：还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（还原型辅酶I）[NicotinamideAdenineDinucleotide(reduced form)] OD260/280：260nm/280nm光密度值(Opticaldensity) PCR：聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction) Real-timePCR：实时荧光聚合酶链式反应(Real-timepolymerasechainreaction) TAMRA：羧基四甲基罗丹明(5-Carboxytetramethylrhodamine) Tris：三羟甲基氨基甲烷[Tris(hydroxymethyl)aminomethane] 5原理 从蜂蜜样品中提取DNA，进行实时荧光qPCR反应。通过荧光信号是否对数增长而判断扩增 是否成功，再通过扩增获得的Ct值大小，判定是否含有薰衣草源成分。 6仪器设备 6.1实时荧光PCR扩增仪 6.2高速冷冻离心机(≥12000r/min) 6.3超微量紫外可见分光光度计 6.4高压灭菌锅 6.5恒温水浴锅 6.6分析天平：感量0.1mg 6.7pH计 6.8微量移液器：量程0.1µL~2.5µL,0.5µL~10µL，2µL~20µL，20µL~200µL,200µL~1000µL。 7试剂和材料 7.1目标基因引物（薰衣草ITS2基因） 7.1.1上游引物F：5’-GCAGCGTTCGGGCTTAACTCACC-3’ 7.1.2下游引物R：5’-CAACTTGCGTTCAAAGACTCGATGGTT-3’ 7.1.3荧光探针P：FAM-5’-GGGCAGCGGGCGTCTATCGAATGTCA-3’-TAMRA 7.2内参引物（显花植物NADH基因引物）GH/T1532—2026 37.2.1上游引物F：5’-GCTGAAGCAGCTACTTTCGAAGTAACA-3’ 7.2.2下游引物R：5’-AGGAGCCGTGTGAGATGAAAGTCTCA-3’ 7.2.3荧光探针P：FAM-5’-TGGAGTGGGAGAGTCAGAGTCGAAAAGAGG-3’-TAMRA 7.3对照样品 7.3.1阴性对照：非薰衣草植物DNA（如油菜、党参、茶等）。 7.3.2阳性对照：薰衣草DNA。 7.3.3空白对照：实时荧光PCR反应时以水代替扩增DNA模板。 7.4试剂 除非另有规定，本文件中所用试剂均为分析纯，水应符合GB/T6682一级水的规定。 7.4.1适合荧光探针法的实时荧光PCR反应试剂(2×) 7.4.2实时荧光PCR专用参比染料(50×) 7.4.3CTAB裂解缓冲液和提取缓冲液（配制方法分别见附录A.1与A.2） 7.4.4亚硫酸氢钠(Sodiumdisulphite) 7.4.5聚乙烯吡咯烷酮-40(PVP-40) 7.4.65%十二烷基肌氨酸钠（配制方法见附录A.3） 7.4.7氯仿/异戊醇（体积比24:1） 7.4.8异丙醇(-20℃预冷) 7.4.970%乙醇（体积比） 7.4.10三羟甲基氨基甲烷(Tris) 7.4.11乙二胺四乙酸(EDTA) 7.4.12氯化钠(NaCl) 7.4.13浓盐酸(HCl) 7.4.14氢氧化钠(NaOH) 7.4.15山梨醇(Sorbitol) 7.5提取工作液准备 分别吸取41.7mLCTAB裂解缓冲液(7.4.3)和提取缓冲液(7.4.3)，再依次加入0.5g亚硫酸氢钠和2g 聚乙烯吡咯烷酮-40，充分振荡混匀，用5%十二烷基肌氨酸钠定容至100mL。工作液需现用现配。 8试样制备和保存GH/T1532—2026 4对无结晶的蜂蜜样品，将其搅拌均匀；对有结晶的样品，在密闭的情况下，置于不超过60℃的水 浴中温热，振荡，待样品全部融化后搅拌，冷却至室温。分出200g作为试样，置于样品瓶中，密封， 并做上标记。室温下保存。 9操作程序 9.1样品处理和DNA提取 9.1.1称取25g蜂蜜样品至50mL离心管中，加入30mL水，振荡混匀。于4℃、8000r/min下离心 25min。 9.1.2弃上清液，加入于1mL现配的工作液（见7.5）。充分混匀后，于37℃水浴12~16h。 9.1.3向样品中加入1mL氯仿/异戊醇（体积比24:1），缓慢颠倒混匀10min，于12000r/min离心 10min。 9.1.4转移上清至新离心管中，加入等体积-20℃预冷的异丙醇。12000r/min离心10min。 9.1.5弃上清，DNA位于沉淀中，加入500μL70%乙醇溶液洗涤沉淀，12000r/min离心5min。 9.1.6弃去乙醇，室温晾干至乙醇完全挥发,加50μL水溶解DNA，于–20℃保存。 9.2提取DNA的浓度和OD260/280测定 吸取1μLDNA提取液（步骤9.1.6），利用超微量紫外可见分光光度计测定提取DNA样品的浓度 （单位为ng/µL）和OD260/280数值（1.7~2.0适宜PCR扩增）。 9.3实时荧光PCR扩增 9.3.1实时荧光PCR反应体系 实时荧光PCR反应体系按表1规定配制，检测过程中设置阳性对照、阴性对照和空白对照。配制反 应液时应避免强光，且防止产生气泡。 表1实时荧光PCR反应体系配制表 体系组分体积(μL) 内参基因 目标基因 实时荧光PCR反应液适合荧光探针法的qPCR反应试剂(2×) 10.0 10.0 ddH2O 6.0 3.2 上游引物F(10μM) 0.4 0.8 下游引物R(10μM) 0.4 0.8 荧光探针P(10μM) 0.8 0.8 ROXReferenceDye(50×) 0.4 0.4 样品 DNA(100.0-500.0ng/μL) 2.0 4.0 总体积 20 20