2 0 2 5 1 2 0 9 发 布 － － 2 0 2 6 0 5 0 1 － － 实 施 向 日 葵 品 种 及 其 实 质 性 派 生 品 种 鉴 定 M N P 分 子 标 记 法 0 5 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 0 2 0 . 0 1 C C S B 4 9 1 8 — 2 0 2 5 I d e n t i f i c a t i o n o f s u n f l o w e r v a r i e t i e s a n d t h e i r e s s e n t i a l l y d e r i v e d v a r i e t i e s — M N P m a r k e r m e t h o d Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４９１８—２０２５ 目　　次 前言 Ⅱ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １　范围 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ２　规范性引用文件 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ３　术语和定义 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ４　原理 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ５　试剂和材料 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ６　仪器设备 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ７　操作程序 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ８　质量控制 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ９　数据分析 ３ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １０　结果判定与表述 ４ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录A(规范性)　MNP标记和标记检测引物 ５ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录B(资料性)　溶液配制 １１３ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录C(资料性)　品种鉴定流程示例 １１４ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ⅠNY/T４９１８—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部种业管理司提出. 本文件由全国植物新品种测试标准化技术委员会(SAC/TC２７７)归口. 本文件起草单位:巴彦淖尔市农牧业科学研究所、农业农村部科技发展中心、江汉大学、内蒙古自治区 中蒙医药研究院、河套学院、三瑞农业科技股份有限公司. 本文件主要起草人:杜瑞霞、杨钦方、韩瑞玺、彭海、单飞彪、张凯淅、刘春晖、王永行、陈舒舒、荆若男、 陈阳、段如文、闫文芝、马捷、李甜甜、方治伟、周俊飞、马莹雪、李嫒嫒、李煜、段悦、李逢州、李军、邬雪瑞、常 敏、杨立全、王星、徐广祥. ⅡNY/T４９１８—２０２５ 向日葵品种及其实质性派生品种鉴定 MNP分子标记法 １　范围 本文件规定了利用多核苷酸多态性(MultipleNucleotidePolymorphism,MNP)标记法进行向日葵 (HelianthusannuusL􀆰)品种鉴定及其实质性派生品种鉴定的术语和定义、原理、试剂和材料、仪器设备、 操作程序、质量控制、数据分析、结果判定与表述. 本文件适用于向日葵品种及其实质性派生品种的鉴定. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本 文件. GB/T３５４３􀆰２　农作物种子检测规程　第２部分:扦样 GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 GB/T３８５５１　植物品种鉴定　MNP标记法 ３　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件. ３􀆰１ 多核苷酸多态性　multiplenucleotidepolymorphism,MNP 在一段核苷酸序列中,由一个或多个核苷酸变异引起的序列多态性. [来源:GB/T３８５５１—２０２０,３􀆰１,有修改] ３􀆰２ 实质性派生品种　essentiallyderivedvariety,EDV 由原始品种实质性派生,或者由该原始品种的实质性派生品种派生出来的品种,与原始品种有明显区 别,并且除派生引起的性状差异外,在表达由原始品种基因型或者基因型组合产生的基本性状方面与原始 品种相同. ３􀆰３ 平均覆盖倍数　averagecoverage 在基因组上比对到所有标记位点上的测序片段的总数与标记位点总数的比值. ３􀆰４ 检出标记位点　detectedmarkers 至少有一个等位基因型且有２０条及以上测序片段支持的标记位点. ４　原理 向日葵品种的基因组中存在着能够世代稳定遗传的MNP位点,不同向日葵品种间同一组MNP位点 的序列上可能存在差异,这种差异可通过基于PCR、二代高通量测序以及生物信息学方法进行检测,进而 区分不同的品种. ５　试剂和材料 除非另有规定,仅使用分析纯试剂,实验用水符合GB/T６６８２中规定的一级水的要求. １NY/T４９１８—２０２５ ５􀆰１　多重PCR扩增与文库构建试剂盒 应匹配MNP标记和标记检测引物,以及高通量测序试剂盒. ５􀆰２　高通量测序试剂盒 应匹配高通量测序仪. ５􀆰３　MNP标记和标记检测引物 应符合附录A的要求. ６　仪器设备 ６􀆰１　离心机 最大转速度不小于１２０００r/min. ６􀆰２　电泳仪 ６􀆰３　PCR扩增仪 ６􀆰４　高通量测序仪 测序读长不小于３００bp. ６􀆰５　计算机服务器 ７　操作程序 ７􀆰１　样品准备 送检样品宜为种子、幼苗、叶片等组织或器官.试验样品抽取的样本数量宜为３０个以上.样品需要 扦样时,应符合GB/T３５４３􀆰２的规定.样品可以混合检测,必要时进行个体检测. ７􀆰２　DNA提取 ７􀆰２􀆰１　CTAB法 将混合样品在液氮中研磨至粉末,迅速取约２００mg粉末置于２􀆰０mL离心管中;每管加入６００μL ６５℃预热的CTAB提取液,充分混合,６５℃水浴４５min~６０min,每间隔１５min轻缓颠倒混匀,水浴后 １２０００r/min离心１０min.吸取上清液转移至新的离心管中,每管加入与提取液等体积的三氯甲烷和异 戊醇,轻缓混匀后静置１０min;１２０００r/min离心１０min后吸取上清液至新的离心管中,加入等体积预冷 的异丙醇,轻轻颠倒混匀,－２０℃放置３０min,DNA沉淀后１２０００r/min离心１０min.弃上清液,用体 积分数为７０％的乙醇溶液洗涤沉淀２遍,晾干,加入１００μL双蒸水或TE缓冲液充分溶解.检测DNA 浓度和质量,－２０℃保存备用.CTAB法提取溶液的配制参照附录B. 注１:以上为推荐的DNA提取方法,DNA质量能够满足PCR扩增要求的其他DNA提取方法均适用于本文件.DNA 溶液的紫外吸光度OD２６０与OD２８０的比值宜介于１􀆰７~２􀆰０. 注２:三氯甲烷和异戊醇混合液中三氯甲烷与异戊醇的体积比为２４∶１. ７􀆰２􀆰２　试剂盒提取法(仲裁法) 利用核酸提取试剂盒提取待测样品DNA.提取的DNA在２６０nm与２３０nm处的吸光度值的比值 大于２􀆰０,２６０nm与２８０nm处的吸光度比值介于１􀆰７~１􀆰９.方法见附录C中的C􀆰２. ７􀆰３　多重PCR扩增与文库构建 按多重PCR扩增与文库构建试剂盒的说明书进行DNA质控、多重PCR扩增、文库构建与纯化.其 中,多重PCR的扩增循环数不高于２０次.方法见C􀆰３. ７􀆰４　高通量测序 按高通量测序试剂盒和高通量测序仪的操作说明,对７􀆰３中获得的测序文库进行高通量测序.高通 量测序的平均覆盖倍数宜设置为７００倍以上,测序长度不小于３００bp.方法见C􀆰４. ８　质量控制 ８􀆰１　环境 ２NY/T４９１８—２０２５ 样品准备、DNA提取、多重PCR扩增、文库构建和高通量测序宜在规定的区域或相互隔离的区域按 单一方向进行操作,不同区域的仪器设备需专用. ８􀆰２　测序数据 ８􀆰２􀆰１　高通量测序原始数据质量应满足所采用的高通量测序仪的操作手册中所规定的测序质量要求. ８􀆰２􀆰２　将样品的测序数据比对到参考基因组的标记位点上,统计第一次检测的标记位点的平均覆盖倍数 C１. ８􀆰２􀆰３　当C１小于５００时,判定样品的测序数据量不足,从７􀆰４或之前的步骤开始重新实验至检测标记位 点的平均覆盖倍数C１大于或等于５００. ８􀆰２􀆰４　当C１大于或等于５００时,计算检出标记位点的比例R１. R１按完成式(１)计算． R１＝T１ T×１００ (１) 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 式中: R１———样品检出标记位点的比例,单位为百分号(％); T１——