2 0 2 5 1 2 0 9 发 布 － － 2 0 2 6 0 5 0 1 － － 实 施 棉 花 品 种 纯 度 鉴 定 S S R 分 子 标 记 法 0 4 中 华 人 民 共 和 国 农 业 行 业 标 准 备 案 号 ： X X X X - X X X X Ｉ Ｃ Ｓ 6 5 . 0 2 0 . 0 1 C C S B 4 9 3 3 — 2 0 2 5 C o t t o n ( G o s s y p i u m s p p L . ) v a r i e t a l p u r i t y t e s t i n g — S S R b a s e d m e t h o d s Ｎ Ｙ ／ Ｔ 中 华 人 民 共 和 国 农 业 农 村 部 发 布NY/T４９３３—２０２５ 目　　次 前言 Ⅱ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １　范围 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ２　规范性引用文件 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ３　术语和定义 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ４　缩略语 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ５　原理 １ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ６　检测方案 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ７　试剂和溶液配制 ２ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ８　仪器设备 ３ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ９　检测程序 ３ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １０　结果计算与表示 ６ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 １１　结果报告 ６ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录A(资料性)　溶液配制 ７ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 附录B(资料性)　真实性鉴定引物 ９ 􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺􀆺 ⅠNY/T４９３３—２０２５ 前　　言 本文件按照GB/T１􀆰１—２０２０«标准化工作导则　第１部分:标准化文件的结构和起草规则»的规定 起草. 请注意本文件的某些内容有可能涉及专利.本文件的发布机构不应承担识别专利的责任. 本文件由农业农村部种业管理司提出. 本文件由全国农作物种子标准化技术委员会(SAC/TC３７)归口. 本文件起草单位:中国农业科学院棉花研究所、全国农业技术推广服务中心、新疆维吾尔自治区种业 发展中心、新疆农业科学院、新疆生产建设兵团种子管理总站. 本文件主要起草人:匡猛、晋芳、吴玉珍、张胜、彭军、孔杰、金石桥、侯新河、周大云、赖波、黄龙雨、刘丰 泽、黄义文、王延琴、付守阳、栗战帅、帕丽旦􀅰艾海提、高翔、刘金山、张力科、任雪贞、史庆玲、马晓宁、 李曼、廉英杰、王秀芳、吕丽敏、孔德培、刘爱忠、付小琼、李超. ⅡNY/T４９３３—２０２５ 　 　 　棉花品种纯度鉴定　SSR分子标记法 １　范围 本文件界定了棉花(GossypiumsppL􀆰)品种纯度SSR分子标记方法的术语和定义、缩略语,规定了 原理、检测方案、试剂和溶液配制、仪器设备、检测程序、结果计算与表示和结果报告. 本文件适用于棉花品种纯度鉴定,不适用于转基因品种转化体纯度鉴定. ２　规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中,注日期的引用文件,仅 该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件. GB/T３５４３􀆰１　农作物种子检验规程　第１部分:总则 GB/T３５４３􀆰２　农作物种子检验规程　第２部分:扦样 GB/T６６８２　分析实验室用水规格和试验方法 ３　术语和定义 下列术语和定义适用于本文件. ３􀆰１ 品种纯度　varietalpurity 品种在特征特性方面典型一致的程度,用本品种的种子数占供检本作物样品种子数的百分率表示. ３􀆰２ 引物　primer 一条互补结合在模板DNA链上的短单链,能提供３′ＧOH末端作为DNA合成的起始点,延伸合成模 板DNA的互补链. ３􀆰３ 组合引物　panel 能够组合在一起电泳、标记不同颜色或相同颜色荧光而扩增片段大小不同的一组引物. ４　缩略语 下列缩略语适用于本文件. bp:碱基对(basepair) CTAB:十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrimethylammoniumbromide) DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid) dNTPs:脱氧核苷三磷酸(deoxyribonucleosidetriphosphates) PAGE:聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis) PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction) SDS:十二烷基磺酸钠(sodiumdodecylsulfate) SSR:简单序列重复(simplesequencerepeat) Taq酶:耐热DNA聚合酶(TaqＧDNApolymerase) ５　原理 棉花的不同品种,其基因组存在着能够世代稳定遗传的SSR的重复次数差异.这种差异可以通过从 抽取有代表性的检测样品中提取DNA,用SSR引物进行扩增和电泳,通过检测其扩增产物片段大小而加 １NY/T４９３３—２０２５ 以区分. 采用经筛选能准确识别品种异常个体指纹的适宜引物,对一定数量送验样品的正常个体数目或百分 率进行测算,从而对样品整体的典型一致程度作出评价. ６　检测方案 ６􀆰１　总则 样品状况、引物、检测平台不同,其检测结果准确度可能有所不同.应依据“适于检测目的”的原则,统 筹考虑检测规模和检测能力,选定适宜的样品数量、引物、检测平台,制订相应的检测方案. 在严格控制条件下,合成选择的引物,按照确定的检测平台对检测样品按DNA提取、PCR扩增、电 泳、数据分析的程序进行检测. 按规定要求填报检测结果,检验报告应注明影响检测结果的关键信息. 品种纯度鉴定,必要时应先对该品种进行真实性鉴定. ６􀆰２　样品 ６􀆰２􀆰１　送验样品为种子,质量应不低于５００g. ６􀆰２􀆰２　从送验样品中随机分取规定数量的试样,试样的分取符合GB/T３５４３􀆰２的规定.试样不少于１００ 粒种子,检测样品可以是种子、胚芽、幼苗或叶片. ６􀆰３　引物 ６􀆰３􀆰１　异常个体的类型不同,所选引物和数目也有所不同. ６􀆰３􀆰２　常规种纯度检测可采用１０个SSR引物同时检测所有个体,也可以通过混合样品(７０个个体以上) 试验,筛选混合样品中出现杂合的SSR位点进行检测;杂交种纯度检测需要通过混合样品(７０个个体以 上)试验,筛选混合样品中出现杂合的SSR位点进行检测.当样品在个别位点存在遗传不稳定状况的,可 将该位点剔除;检测样品存在严重遗传不稳定状况的,可终止纯度检测. ６􀆰４　检测平台 ６􀆰４􀆰１　扩增产物可采用变性PAGE垂直板电泳、毛细管电泳,在选择等位基因扩增片段差异较大的引物 前提下也可采用非变性PAGE垂直板电泳. ６􀆰４􀆰２　对于检测样品量较大的,可将组织研磨仪、DNA自动提取和移液工作站、高通量PCR扩增仪、毛 细管电泳仪进行组合,提高检测的综合效率. ６􀆰４􀆰３　DNA提取、PCR扩增、电泳的技术条件要求,在适于检测目的和不影响检测质量的前提下,按照 检测平台的要求允许对本文件的规定作适当调整. ６􀆰５　检测条件 应在有利于检测有效实施的控制条件下进行,包括但不限于下列条件: a)　种子检验员具备熟悉所使用检测技术的知识和技能; b)所有仪器与使用的技术相适应,并已经过定期维护、验证和校准; c)使用适当等级的试剂和灭菌处理的耗材; d)使用校准影响检测结果评定的适宜参照样品. ７　试剂和溶液配制 ７􀆰１　试剂 ７􀆰１􀆰１　DNA提取 CTAB、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、乙二胺四乙酸二钠(EDTAＧNa２􀅰２H２O)、三羟甲基氨基甲烷 (TrisＧbase)、盐酸、氢氧化钠、氯化钠、βＧ巯基乙醇(βＧMercaptoethanol)、乙醇(７０％)、SDS、无水乙醇. ７􀆰１􀆰２　PCR扩增 引物、DNA、dNTPs、Taq酶、１０×缓冲液、ddH２O和Mg２＋或者Mix反应混合液. ２NY/T４９３３—２０２５ ７􀆰１􀆰３　电泳 ７􀆰１􀆰３􀆰１　荧光毛细管电泳 DNA分析仪专用的丙烯酰胺胶、分子量内标、去离子甲酰胺、电泳缓冲液. ７􀆰１􀆰３􀆰２　变性PAGE垂直板电泳 去离子甲酰胺(Formamide)、溴酚蓝(BromophenolBlue)、二甲苯青FF、甲叉双丙烯酰胺(BisacrylＧ amide)、丙烯酰胺(Acrylamide)、硼酸(BoricAcid)、尿素、亲和硅烷(BindingSilane)、疏水硅烷(RepelSiＧ lane)、DNA分子量标准、无水乙醇、