ICS 65.020.01 CCS B 05 DB23 黑 龙 江 省 地 方 标 准 DB23/T 3318—2022 元蘑液体菌种生产技术规程 2022-08-22 发布 黑龙江省市场监督管理局 2022-09-21 实施 发 布 DB23/T 3318—2022 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本文件由黑龙江省林业和草原局提出。 本文件起草单位：哈尔滨学院、哈尔滨职业技术学院、鹤岗市十八号林场、绥棱具国有林场三吉台 林场、逊克县林业工作总站、黑龙江省知识产权保护中心。 本文件主要起草人：孙婷婷、刘瑞鹏、高静波、赵妍、李贵军、杜鹏禹、张春红、刘增才、李亚伟、 耿楠楠。 I DB23/T 3318—2022 元蘑液体菌种生产技术规程 1 范围 本文件规定了元蘑（Hohenbuehelia serotina）液体菌种生产的环境条件要求、生产车间的设计、 生产仪器和设备、菌种选择、母种制备、摇瓶液体种制备、发酵罐空消、制备发酵罐液体种培养基、发 酵罐液体种的接种、发酵罐液体种培养条件、发酵罐液体种检测、发酵罐液体种质量要求和生产档案。 本文件适用于元蘑液体菌种生产。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 150.1 压力容器 第 1 部分：通用要求 GB/T 1921 工业蒸汽锅炉 参数系列 GB 5749 生活饮用水卫生标准 GB/T 11165 实验室 pH 计 GB/T 13554 高效空气过滤器 GB 19153 容积式空气压缩机能效限定值及能效等级 GB 50073 洁净厂房设计规范 NY/T 528 食用菌菌种生产技术规程 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 环境条件要求 应符合 NY/T 528 的规定。 5 生产车间的设计 应符合 GB 50073 的规定。 6 生产仪器和设备 生产仪器设备要求如下： a）液体种发酵罐质量应符合 GB 150.1 的规定； b）空气压缩机质量应符合 GB 19153 的规定； c）空气过滤器质量应符合 GB/T 13554 的规定； 1 DB23/T 3318—2022 d）pH 计质量应符合 GB/T 11165 的规定； e)蒸汽锅炉质量应符合 GB/T 1921 的规定； f）超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、恒温振荡培养箱、冰箱、显微镜、液体菌种接种 枪、磅秤、天平应符合 NY/T 528 的规定。 7 菌种选择 选择菌丝生长健壮、产量高、抗逆性强、抗杂菌能力强的菌种。 8 8.1 母种制备 母种培养基的制作 制作马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA），装入试管（18 mm × 180 mm 或 20 mm × 200 mm）中， 分装量应为试管长度的 1/5～1/4，应使用棉塞或硅胶塞封口，其中棉塞应使用梳棉，不应使用脱脂棉。 将试管放入高压蒸汽灭菌锅中，在 0.105 Mpa～0.125 Mpa 下灭菌 30 min。灭菌后摆放成的斜面培养基 顶端应距试管口≥50 mm。 8.2 接种与培养 在无菌条件下，用接种钩取黄豆粒大小的初始菌种接种在母种培养基上。母种培养的温度应为22 ℃ ±1 ℃，空气相对湿度控制在65%～75%，通风、避光培养8 d～10 d。 9 9.1 摇瓶液体种制备 摇瓶液体种培养基配方 推荐培养基配方：葡萄糖 20 g、玉米粉 10 g、酵母粉 5 g、蛋白胨 3 g、磷酸二氢钾 2 g、硫酸镁 1 g、水 1000 mL。水的质量应符合 GB 5749 的规定。 9.2 摇瓶液体种培养基的制作、灭菌 将配方中的原料充分混合均匀，装入 500 mL 或 1000 mL、耐 126 ℃高温、无色或近无色的玻璃三 角瓶中，装液量宜为三角瓶体积的 1/4，用 16 cm × 16 cm 聚乙烯透气封瓶膜封口。在 0.105 Mpa～0.125 Mpa 下灭菌 30 min。 9.3 摇瓶液体种的接种与培养 在无菌条件下，用接种铲将 1/4～1/3 的斜面母种接入摇瓶液体培养基中，置于恒温振荡培养箱， 在 22 ℃以 140 r/min 振荡培养 5 d～7 d。 10 发酵罐空消 发酵罐初次使用，或出现染菌，或长期放置时，应检查发酵罐上全部阀门和压力表，进行空消。空 消时罐内蒸汽压力应控制在 0.105 Mpa～0.125 Mpa、温度应控制在 121 ℃～124 ℃灭菌 40 min。 11 2 制备发酵罐液体种培养基 DB23/T 3318—2022 11.1 发酵罐液体种培养基配方 在9.1配方的基础上应加入2.9 mL/L的消泡剂（如豆油）。 11.2 初始 pH 值 pH 值为 5.5～6.0。 11.3 投料与定容 将 11.1 中的原料按比例充分混合均匀，倒入发酵罐中，加水定容至罐体总容积的 65%～70%，拧紧 上料口盖。 11.4 灭菌 液体种发酵罐内蒸汽压力控制在 0.105 Mpa～0.125 Mpa，温度控制在 121 ℃～124 ℃灭菌 40 min。 11.5 冷却 灭菌结束后应将冷水通入发酵罐夹层或者内置冷却系统中循环，使培养基降温至 22 ℃～24 ℃。 降温过程中应及时向发酵罐内通入无菌风。 12 发酵罐液体种的接种 用带有手柄的内径略大于接种口的铁丝圈缠绕纱布，蘸上 95%的酒精，套在接种口上点燃。打开摇 瓶液体种封瓶膜，用火焰灼烧瓶口 30 s～40 s，打开接种口盖，将摇瓶液体种迅速倒入罐中，接种量 为培养基体积的 0.1%～0.2%。迅速盖好接种口，拧紧。 13 13.1 发酵罐液体种培养条件 通气量 3 3 每升发酵液宜通入无菌空气 0.04 m /h～0.06 m /h。 13.2 罐压 保持在 0.03 Mpa～0.05 Mpa。 13.3 培养温度 宜控制在 22 ℃±1 ℃。 13.4 培养时间 宜控制在 5 d～7 d。 14 14.1 发酵罐液体种检测 取样 接种 2 d 后进行检测，用酒精火焰灼烧取样阀 30 s～40 s，弃掉最初流出的少量液体种，取 30 mL～ 3 DB23/T 3318—2022 50 mL 液体种放入无菌 150 mL 三角瓶中，塞紧棉塞。取样后应用酒精火焰把取样阀烧干。 14.2 检测 对 14.1 所取样品在 PDA 平板培养基上画线培养，在 22 ℃±1 ℃下培养 2 d～3 d，每天观察菌落 生长情况，若 PDA 平板培养基上没有杂菌生长，则表明菌种合格。用显微镜检测菌丝生长发育状态。 15 15.1 发酵罐液体种质量要求 感官指标 应符合表 1 的要求。 表 1 发酵罐液体种感官指标 项 目 15.2 指 标 菌液色泽 球状菌丝体呈乳白色，滤液呈黄棕色 菌液形态 菌液澄清透明不浑浊，稍粘稠，有大量球状菌丝体悬浮、分布均匀、不迅速分层 菌液气味 有元蘑菌种培养时特有的香味，无异味，发酵罐排气口气味正常 理化指标 应符合表 2 的要求。 表 2 发酵罐液体种理化指标 16 项 目 指 标 pH 值 3.5~5.5 菌丝湿重（g／100 mL） ≥5 显微镜下菌丝形态 菌丝粗壮，有球状和丛状菌丝，分布均匀 样品无菌检查 有元蘑菌丝生长，无霉菌、酵母菌、细菌等杂菌生长 生产档案 应建立生产档案，内容包括：环境条件要求、生产车间的设计、生产仪器和设备、菌种选择、母种 制备、摇瓶液体种制备、发酵罐空消、制备发酵罐液体种培养基、发酵罐液体种的接种、发酵罐液体种 培养条件、发酵罐液体种检测、发酵罐液体种质量要求等。 4