ICS 65.020.30 CCS B 41 15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 2727—2022 牛冠状病毒腹泻诊断技术规范 Technical specification for diagnosis of bovine coronavirus diarrhea 2022-07-29 发布 2022-08-29 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 DB15/T 2727—2022 前 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 起草。 言 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC 19）归口。 本文件起草单位：内蒙古农业大学、内蒙古自治区动物疫病预防控制中心、中国农业科学院哈尔滨 兽医研究所、金宇保灵生物药品有限公司、通辽市农业技术推广中心。 本文件主要起草人：徐晓静、谢梦圆、王建龙、常继涛、马立峰、郭宇、黄海碧、陈坚、刘景龙。 I DB15/T 2727—2022 牛冠状病毒腹泻诊断技术规范 1 范围 本文件规定了牛冠状病毒腹泻的临床诊断和实验室诊断技术方法、操作程序和判定标准。 本文件适用于奶牛饲养场（户）、肉牛饲养场（户）和动物诊疗单位对牛冠状病毒腹泻的检测、诊 断和检疫等。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 27401 实验室质量控制规范 动物检疫 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BCoV：牛冠状病毒（Bovine coronavirus） CPE：致细胞病变效应（Cytopathic Effect） DMEM：最低营养需要培养基（DuLbecco’s Modified Eagle Medium） FBS：胎牛血清（Fetal Bovine Serum HRT-18 细胞：人直肠肿瘤 18 细胞（Human Rectal tumor-18 cell） PBS：磷酸盐缓冲盐水（Phosphate Buffer Saline） PCR：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction） TCID50：半数组织培养物感染量（Median Tissue Culture Infective Dose） 5 生物安全措施 样品处理的生物安全措施符合GB 19489的规定。 样品采集的生物安全措施符合GB/T 27401的规定。 6 病原 1 DB15/T 2727—2022 牛冠状病毒属冠状病毒科，乙型冠状病毒属，病毒颗粒为球状，直径通常在80 nm～120 nm，具有 囊膜和棒状纤突，核衣壳螺旋状对称。基因组为单股正链RNA。 7 临床诊断 流行病学 7.1.1 易感动物 7日龄的犊牛易感，其他日龄犊牛及成年牛也可感染。 7.1.2 传染源 病牛是本病自然流行的主要传染源，犊牛一旦感染，可排出大量病毒粒子。 7.1.3 传播途径 经消化道、呼吸道及接触传播。 7.1.4 流行特点 冬春季节多发，腹泻通常在同一牛场连续发生。 临床症状 犊牛感染后发生腹泻，发病初期出现带血的黄色黏性粪便，后期发展为水泻，有时出现脱水、虚弱、 体温低，少数犊牛出现发热、卧地不起等症状，严重的犊牛会出现昏迷甚至死亡。成年牛常突然暴发， 排出深褐色带血稀粪，伴有产奶下降、沉郁及厌食等症状。 病理变化 小肠肠壁变薄、透明，肠腔液体增多，严重者引起腹腔积水，胃内有未消化的凝乳块。感染的牛可 能伴随呼吸道症状，表现为气管黏膜充血、局限性肺炎等。 结果判定 符合6.1、6.2、6.3，可判定为牛冠状病毒腹泻疑似病例。 8 实验室诊断 主要仪器设备 电镜、低温高速离心机、倒置显微镜、T25细胞培养瓶、CO2细胞培养箱、96孔细胞培养板、PCR仪、 PCR管、电泳仪、凝胶成像仪、酶标仪。 主要试剂 PBS、2%磷钨酸、DMEM培养基、细胞培养液、细胞维持液、胰酶、HRT-18细胞、PCR Taq酶、DNA Marker、 TAE电泳缓冲液。主要试剂配制见附录A。 样品采集与处理 2 DB15/T 2727—2022 8.3.1 粪便样品 将棉拭子伸入肛门内刮取新鲜粪便，也可无菌采集地上刚排出的新鲜粪便。分别放入装有 3 mL PBS 的采样管中，编号并记录相关信息。 漩涡振荡器充分振荡， 12000 r/min 4 ℃离心5 min～8 min，取上清编号备用。 8.3.2 组织样品 取病死牛小肠及内容物等，置于无菌密封袋或采样杯内。 称取1 g样品置于研钵，充分研磨后加5 mL PBS混匀， 8000 r/min 4 ℃离心5 min，取上清编号备 用。 8.3.3 血液样品 一次性采血管采集血液2 mL～4 mL，犊牛采用颈静脉采血，成年牛采用尾静脉采血。 室温静置30 min，3000 r/min～4000 r/min 离心5 min～10 min。分离血清编号备用。 样品运输与保存 采集的样品应低温运送，尽量12 h内运送至实验室。 采集或处理后的样品在2 ℃～8 ℃保存，一般不超过24 h，若长期保存，应置于-70 ℃以下条件保 存。 病原学检测 8.5.1 电镜检查 将采集的粪便或肠内容物用PBS制成1: 4 悬液，于盛有玻璃珠的管内充分震荡30 min，取悬液 3000 r/min 离心30 min，取上清，15000 r/min 离心30 min，取上清，以40000 r/min～50000 r/min 离心 4 h～5 h，弃上清，加1～2滴蒸馏水悬浮，滴加铜网，2%磷钨酸染色，电镜下观察病毒粒子形态。 8.5.2 病毒分离鉴定 8.5.2.1 单层细胞制备 HRT-18 细胞可用于牛冠状病毒分离培养。 6 用胰酶消化细胞，加入至少等体积的细胞培养液终止，吹打混匀，使其分散浓度为1～2×10 个/毫 升，分装到T25细胞培养瓶，置于5% CO2 培养箱中37 ℃培养24 h～48 h。随时观察细胞生长情况，待细 胞长成单层备用。 8.5.2.2 接种细胞 将处理后的样品用细胞维持液制成1:5悬液，漩涡振荡器混匀， 3000 r/min 4 ℃离心10 min，用 0.22 µm 滤膜过滤后取上清，添加浓度为20 µg/mL～30 µg/mL胰酶，37 ℃水浴激活1 h。每份样品接种 3 瓶细胞，设置正常细胞对照组。接种前，先弃去细胞培养瓶中液体，按细胞维持液终体积的10%加入 处理好的样品，37 ℃吸附1 h，期间每隔20 min摇晃一次，吸附完成后补加含15 µg/mL～25 µg/mL 胰 酶的细胞维持液。对照组不接种样品，弃去培养液后加入等量细胞维持液。均置于5% CO2 培养箱中37 ℃ 静置培养。 8.5.2.3 观察和记录 3 DB15/T 2727—2022 每天观察细胞状态并记录，连续观察4 d～5 d。如对照组细胞单层完好，细胞生长正常，接种样品 的细胞出现CPE，且80%以上细胞出现时，置-70 ℃ 以下冻存。若接种的细胞无CPE出现，反复冻融3次， 进行盲传。 8.5.2.4 盲传 将第1代无 CPE 的细胞培养物冻融3次后混合，8000 r/min 4 ℃离心5 min，取上清继续接种细胞， 进行观察、记录、收毒，盲传第2代。此过程中培养物仍无CPE则按同样的方法盲传5～7代，若出现CPE， 达到80%以上时收毒，置-70 ℃以下冻存。 8.5.2.5 中和试验 8.5.2.5.1 单层细胞制备 6 将细胞浓度制备为1～2×10 个/毫升，于96孔板培养，每孔100 µL，加细胞培养液补齐至1毫升/孔， 置于5% CO2 培养箱37 ℃培养24 h。 8.5.2.5.2 固定血清-稀释病毒法 -1 -8 用DMEM培养基将病毒液进行梯度稀释（10 ～10 ）；将不同稀释梯度的病毒液和已灭活的血清等体 积混合，37 ℃水浴感作1 h；取混合液200 µL分别加至已长成单层细胞的96孔细胞培养板，每个稀释梯 度接种4孔；同时设对照非免疫血清（对照组）和正常细胞各4孔。于5% CO2 培养箱37 ℃培养，计算每 组的TCID50和中和指数。 8.5.3 PCR 检测 8.5.3.1 总 RNA 提取 将采集的样品或细胞培养物进行处理，按RNA提取试剂盒方法提取核酸。在-20 ℃条件下可短时间 保存，若需长期保存，应置于-70 ℃以下条件，避免反复冻融。 8.5.3.2 引物合成 根据BCoV N基因设计引物。采用常继涛等人文章“载牛冠状病毒N蛋白壳聚糖微球的免疫效果评价” 中BcoV引物序列：BCoV-N-F：GCAATCCAGTAGTAGAGCGT；BCoV-N-R：CTTAGTGGCATCCTTGCCAA。 8.5.3.3 反应体系 按25 µL反应体系配制。 一步法：模板2 µL，上、下游引物各1 µL，One step Taq 酶12.5 µL，RNase-Free H2O 8.5 µL。 两步法：按反转录试剂盒反转为 cDNA；模板2 µL，上、下游引物各1 µL，Taq 酶12.5 µL， RNaseFree H2O 8.5 µL。 8.5.3.4 反应参数 一步法：50 ℃ 30 min；95 ℃ 15 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环； 72 ℃ 10 min。 两步法：95 ℃ 15 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min。 8.5.3.5 电泳检测 4 DB15/T 2727—2022 制备琼脂糖凝胶，取5 µL～8 µL PCR扩增产物加入上样孔，同时加入阳性和阴性对照以及DNA Marker， 于1×TAE电泳缓冲液中进行电泳，凝胶成像仪观察结果。 8.5.3.6 测序分析 PCR扩增产物经胶回收纯化后测序，于NCBI中Blast分析是否为BCoV N基因。 8.5.4 ELISA 检测 待检粪便样品按牛冠状病毒抗原诊断 ELISA 试剂盒操作方法进行样品检测。 8.5.5 结果判定 8.5.5.1 电镜检查结果 可看到直径为80 nm～120 nm的病毒颗粒，外周突起排列成“皇冠”状，即判定样品为BcoV阳性。 8.5.5.2 中和试验结果 当正常对照组孔内细胞单层生长良好，证明试验成立；可根据 Reed-Muench 法计算中和指数（见 附录B），待检血清的中和指数 大于50 (Log ＞ 1.7)，即可判定