ICS 65.120 B46 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3001-2016 饲料中氨基酸的测定 毛细管电泳法 Determination of amino acids in feed- Capillaryelectrophoresis 行业标准信息服务平台 2016-11-01发布 2017-04-01实施 中华人民共和国农业部发布 NY/T3001—2016 前 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由农业部畜牧业司提出。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76）归口。 本标准起草单位：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所[国家饲料质量监督检验中心 （北京）】。 本标准主要起草人：李丽蓓、冯忠华、王彤、饶正华、崔昂、魏书林、张苏、严明、严寒、唐健、田静、 刘晓露。 行业标准信息服务平台 I NY/T3001—2016 饲料中氨基酸的测定 毛细管电泳法 1范围 本标准规定了饲料中氨基酸测定的毛细管电泳法 本标准适用于配合饲料、浓缩饲料、添加剂预混合饲料和饲料原料中氨基酸含量的测定。可测定的 氨基酸种类包括胱氨酸、赖氨酸、精氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、脯氨酸、苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸、 丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸与异亮氨酸之和、酪氨酸和苯丙氨酸的测定，不适用于蛋氨酸和色氨酸含量的 测定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T14699.1饲料采样 GB/T15399—1994饲料中含硫氨基酸测定方法一离子交换色谱法 GB/T18246—2000饲料中氨基酸的测定 GB/T20195动物饲料试样的制备 3原理 样品需在6mol/L盐酸中水解成单一氨基酸，经异硫氰酸苯酯溶液（PITC)衍生，再用毛细管电泳 的方法进行分离和定量。但待测氨基酸不同，前处理方法有所不同。其中，胱氨酸必须在水解前用过甲 酸氧化为磺基丙氨酸，才能衍生测定；而酪氨酸必须用未氧化的样品水解测定；其他氨基酸则可选用上 述任一方法处理测定。 4试剂和材料 除特殊注明外，本标准所用试剂均为分析纯和符合GB/T6682规定的一级水。 4.1碳酸钠溶液，c（NazCO）=01mol/L:取（0.715土0.001）g碳酸钠，加15mL水于25mL的容量 瓶中溶解，用水定容。溶液在塑料瓶中保存2个月。 4.2异硫氰酸苯酯溶液（PITC溶液）：取0.4mLPITC于25mL棕色容量瓶中，用2-丙醇定容至刻度 并且充分混合均匀。溶液在2℃～8℃的冰箱中保存2个月。取用PITC溶液尽量在通风柜中进行 4.3氢氧化钠溶液：称取2g氢氧化钠于250mL玻璃杯中，用水稀释至100mL。在塑料瓶中保存6 个月。 4.4盐酸，c（HCI)=1.0mol/L：吸取8.3mL浓盐酸，置于容量瓶中，用水稀释并定容至100mL。 4.5磷酸氢二钠溶液：取（4.78土0.01）g十二水磷酸氢二钠于100mL容量瓶中，溶解后定容。溶液 保存2个月。 4.6磷酸二氢钠溶液：取（2.28土0.01）g一水合磷酸二氢钠或（2.57土0.01）g二水合磷酸二氢钠于 100mL容量瓶中，溶解后定容至刻度。溶液保存2个月。 4.7磷酸盐缓冲液（pH7.7~7.8）：取50mL磷酸氢二钠溶液（4.5）和5mL磷酸二氢钠溶液（4.6）于 100mL容量瓶中，用水定容。溶液保存2个月。 1 NY/T3001—2016 4.8β-环糊精溶液：取（0.570土0.001）gβ-环糊精倒入50mL烧杯中，加入25mL~30mL水并充分 混合至完全溶解。若有必要，可将烧杯放在水浴锅中加热（温度不超过50℃）。溶解后转移至50mL的 容量瓶中，用水定容并充分混合。溶液保存2个月。 4.9背景电解液：取10mLβ-环糊精溶液（4.11)和10mL磷酸缓冲液（4.10）于25mL容量瓶中，用水 定容至刻度。溶液保存2周。 4.1013种单一氨基酸储备溶液，4.0mg/mlL：称取精氨酸盐酸盐（0.02420土0.00001)g，一水合组氨 酸盐酸盐（0.02700士0.00001)g.赖氨酸盐酸盐（0.02490±0.00001)g，丙氨酸、天冬氨酸、缬氨酸、甘 氨酸、谷氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸各（0.02000士0.00001g分别置于10mL带 盖瓶中，分别准确加入5mL水溶解。若有必要，可在水浴锅中缓慢加热60℃～70℃来充分地溶解氨基 酸。天冬氨酸和谷氨酸储备液保存1个月，其 .00001）g的两种氨基酸，用1mL U 70℃. 使其完全溶解。储备 液保存2个月。 4.12磺基丙氨酸 (0.04000±0.000 于小玻璃瓶中，加水溶 P 解并定容至10ml 该储备吸可 保存3个 m 4.1313种氨基酸混 氨酸、 异亮氨酸、亮 氨酸、赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸 食、苏氨酸的储备液（4.10）和200苯丙氨酸和酪 盖小瓶中，加入 μL水 并充分混合 每种氨基酸的质量浓度为o.1mg/ 4.143种氨基酸汇 的储备液（4.1 氨酸的 （4.12)，加入1850 开充分混合 每种氨基酸的质量浓度均为0.1mg/ml 5仪器和设备 长范用 5.1毛细管电泳仪 毛细管 cm.内 为240nm~260 nog nm的紫外检测器 C 5.2天平：感量 5.3pH计:(1 5.4离心机：转速 5. 5 干燥箱：恒温精确 5. 6 热空气风扇或氮吹 5.7 滤膜：0.22μm。 6 试样的制备和保存 按GB14699.1的规定抽取有代表性的样品，按四分法取样。按GB/T20195的规定制备试样，粉 碎过0.25mm孔径筛，充分混匀。装入密闭容器中保存。 7分析步骤 7.1样品前处理 7.1.1酸水解法 取0.1g（精确到0.0001g）试样于水解管中按GB/T18246—2000中7.1.1.1常规酸水解法水 解。水解后，取出水解管，冷却至室温，用滤纸过滤，弃去初始滤液，收集剩下滤液于带盖的容器中，待衍 生、测定。 NY/T3001—2016 7.1.2氧化水解法 取0.1000g（精确到0.0001g）试样按GB/T15399—1994中7.1的规定执行。水解后，取出水 解管冷却至室温，用滤纸过滤，弃去初始滤液，收集剩下的滤液于带盖的容器中，待衍生、测定。 7.1.3异硫氰酸苯酯溶液(PITC)衍生 取50μL上述两种水解物（7.1.1和7.1.2)于水解瓶中，并用热空气风扇或氮吹仪（5.6)吹干。依 次加人150μL碳酸钠溶液（4.1）和300μLPITC溶液（4.2）并振荡直到沉淀溶解。盖上瓶盖放在室温 下反应35min，再用热空气风扇或氮吹仪（5.6）吹干。用500μL水溶解残留物，5000r/min离心5min， 上清液过0.22um滤膜（5.7）后用于上机 7.2标准曲线的制备 7.2.113种混合氨基酸的标准曲线 30mL 分别置于3个1.5mL聚丙烯 离心管中，依次加 150 ，涡旋或振荡，然后盖上瓶盖放 在室温下反应 自或氮吹你 6）吹 田 溶解留物，5000r/min离心 min 5min，上清液过0 上机分析。 基酸液 浓度分别为20mg/L、 40mg/L.60 mg 7.2.23种混合氨基酸的标准曲线 吸取3元 种等 氨基酸混合标准溶液（44）0. 0.30ml 个1.5mL聚丙烯离 心管中，以下操作按 2.1规定的方法进行 7.3测定 7.3. 1 电泳分析条 测试操 条件 数 种 氨基酸 波长， 温度， 进样： 一压力，n 时间，5 高压，kV 分析： 一压力，mb 50 时间，min 10~12 注1:13种氨基酸的迁移出峰顺序： rg.Lys,Tyr.Phe.HisLe Val.Pro.Thr,SerAla,Gly 注2:3种氨基酸的迁移出峰顺序：Glu.Asp.Cys 7.3.2定量测定 按由低浓度到高浓度的顺序，分别将混合氨基酸的标准曲线加载到毛细管电泳仪上测定（所得电泳 谱图见附录A），然后测定相应的衍生化试样。以迁移出峰时间定性（识别窗口宽度5%），外标法（以氨 基酸浓度为纵坐标，峰面积为横坐标，绘制标准曲线）定量。 该法可测定各种氨基酸浓度范围见附录A。13种和3种氨基酸的毛细管电泳图谱参见附录B。 如果一种或者几种氨基酸的质量浓度超过了标准曲线的最高点，进一步对水解后的衍生物进行 稀释。 注1：每个测试溶液至少2张电泳图 注2：在进行5个～7个样品检测后，应在仪器进出口换上新的背景电解液。 3 NY/T3001—2016 注3：测定前后毛细管操作处理与冲洗方法参见附录C。 8结果计算与表示 8.1结果计算 试样中氨基酸（胱氨酸除外）含量X以质量分数（%）计，按式（1）计算。 V.XCancl Xi= XDX100 (1) mXV.X1000 式中： Vi 试样水解物体积，单位为毫升（mL）； Cod 每毫升上机溶液中氨基酸的质量，单位为微克每毫升（ug/mL）； Va 用于衍生的水解物的体积，单位为毫升（mL）； D 稀释倍数； m 称取的试样质量，单位为毫克（mg）； 1000 转换系数； 100 百分比系数。 试样中胱氨酸含量X2以质量分数（%）计，按式（2)计算 (2) 169 式中： 120.2 半胱氨酸分子量； 169 磺基丙氨酸分子量。 测定结果用平行测定的算术平均值表示，结果保留两位小数。 9重复性 当含量小于或等于0.5%时，在重复性